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(無題) 削除/引用 No.8603-15 - 2020/01/30 (木) 14:15:42 - AA トピックの趣旨から外れてしまいますが、ご容赦ください。 ガイドRNAの編集効率を見るのであればサンガーシークエンスではだめです。 たまたま極端に悪いガイドを引けばWTの波形で結果が出ますが、 ちょっとでも切れていればシークエンス上はマルチピークになります。 全体のコピーのうちのどのくらいに変異が入るか見ないといけないので surveyor nuclease assayやT7E1アッセイなどの系で調べたほうがいいです。 あるいは、in vitroであれば、今進めているPCRの野生型断片を使って、 制限酵素のように消化後の断片を泳動して未消化との比で効率を測れます。

(無題) 削除/引用 No.8603-14 - 2020/01/30 (木) 02:07:45 - おお >おお先生、その水飽和尿素のプロトコルの詳細を可能でしたら開示していただけませんでしょうか？ 水飽和尿素というのはちょっと変な表現だったかもしれません。要するに水に尿素をとけなくなるまで加えるということです。１．５mlチューブに８割尿素をつめて水を溢れないていどに加えて放置して１５分ほど、または３７度くらいのインキュベーターとかにおいておくといいでしょう。必要量がそれより多ければそれに合わせてスケールを合わせてください。だいたい１１から１２Mの濃度になります。水の代わりに５００mMぐらいのNaClでも構いません。そうすると後で塩を加える必要もないですから。これをサンプルと等量加え尿素が５Mを超えたDNA溶液からエタ沈する（イソプロでもいいです）だけです。 またProK/SDS処理は尿素を使う限りなくてもきれいになると思ってますが、実際にそのようなサンプルでPCRしたことがないので断言できません。 PCRのサイクルですが、タッチダウンを使うと通常の増幅でイマイチだったのがうまくいくことがよくあります。プライマーの長さによりますが。Tmより遥かに高い温度６８から７２どのアニーリング温度で最初のサイクルをまわしそれから少しづつ温度を下げて２５から３０サイクルあたりでプライマーのTm付近（それより少し低くても良い）に達するようにして、気になるならその温度で数回更にサイクルを回してもいいです。指摘温度を決めるのがめんどくさいので最近は増えればいいときは最初からそうしてます。

(無題) 削除/引用 No.8603-13 - 2020/01/29 (水) 15:25:20 - noname 私もPCRさんと同じようなことをちょうどやっていて、同じ目に合っていました。 みなさんは試薬の方でなんとかされているようですが、私はサーマルサイクラーのRampRateをいじったら目的のバンドがしっかり出るようになりました。 メーカー、機種によってかなり差があるので確認してみてはいかがでしょうか。 ちなみに私のサンプルではRampRateを遅めにするときれいなバンドが出ました。

(無題) 削除/引用 No.8603-12 - 2020/01/29 (水) 14:50:12 - AP 35サイクルといえば、増幅効率100% (一サイクルできっちり2倍）なら、標的DNAが1分子しか無いところから始めても、プラトーまで増幅するレベルです。 それでも増えないか増えても非常に収量が悪いなら、PCRの阻害物質が問題かなと思われます。ゲノムDNA相手に特異的プライマーを使ってごく短い標的を増やすだけの実験なので、難度の高いPCRじゃないはずですから。

(無題) 削除/引用 No.8603-11 - 2020/01/29 (水) 14:28:48 - AP 経験上、KOD FXは他の酵素で増えなかったやつでも成功率が高い。 酵素の性能もさることながら、おそらく添付バッファーにPVAかなにか、阻害物質の中和剤的なものが入っているようだ。 あと、MightyAmpやEmeraldAmpあたりも好感触。

(無題) 削除/引用 No.8603-10 - 2020/01/29 (水) 14:22:07 - AP PCIとその後のEtOH pptは品質が良いDNAが得やすいですが、手間がかかるし丁寧にやらないとDNAのロスをしやすいので、スクリーニングのようにハイスループットが求められるときは向きません。薄っすらしか出ないというのもロスがあるからかも。 シリカベースのカラム／プレートでも手間の面ではあまり楽にならないし（繰り返しの液替えや遠心など）、コストが高い。 培養細胞なら夾雑物も少なくlysisも容易なので、簡便な方法で十分でしょう。 ワンチューブでできる方法が良い。それであればPCR用の96 チューブプレートで多サンプル処理もできる。 ・ProK処理後、熱失活処理だけ ・アルカリ法 ・Chelex-100 (Instagene) Chelexはおすすめ。スラリーを入れてボイルして上澄みを少量とってPCR PCRの阻害物質を効果的に除いてくれるので、培養細胞だけでなく、動物組織や細菌なんかでもいける。他の方法は、阻害物質はそのまま残る。 もとはアメリカのCSIがDNA鑑定のため証拠品からPCRするのに使い始めてらしい。 アルカリ法は中和のためピペット操作が一回余分。

(無題) 削除/引用 No.8603-9 - 2020/01/29 (水) 12:20:00 - み PCR酵素の種類を変えるのが手っ取り早いけど、templateの量が多すぎても阻害物質の持ちこみがむしろ増えてPCRかからなくなることある。3倍くらいの希釈系列つくってかかり方を見ておいても良いかも。 アルカリボイル法で普通のTaqは駄目でKOD-FXではゴリゴリにかかった経験ある。

(無題) 削除/引用 No.8603-8 - 2020/01/29 (水) 11:25:04 - PCR おお先生、その水飽和尿素のプロトコルの詳細を可能でしたら開示していただけませんでしょうか？ 誠に恐縮しております....

(無題) 削除/引用 No.8603-7 - 2020/01/29 (水) 11:23:36 - PCR AP先生、ありがとうございます。 PCIを行う前までは、35サイクルで出る時と出ない時があり、出たとしてもうっすらと...でした。 非常にPCR環境の悪いサンプルなのかもしれません... 具体的にはGFP陽性293T細胞を10万個ソートし、遠心したのちに水を加え、煮沸、ボルテックス、といういい加減なサンプルでした。 その後、ProK/SDSとPCIで精製したところ、35で確実にうっすらバンドが出るようになりました。 この一部を取りさらに35かけるとがっつりでました。 ポリメラーゼはクルードサンプルに強いやつというのはおまじない程度だと思っていましたが、そうでもなさそうですね。一度試してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8603-6 - 2020/01/29 (水) 10:13:26 - おお >今回私が行なったPCI精製というのがおお先生の言われる精製のことでしょうか？ そうです。わたしはProK/SDSのあと、PCIはやってもやらなくてもいいですけど、水飽和尿素（室温）を等量入れ、塩を加えてエタ沈です。尿素を加える方法は昔ここで教えてもらいました。ただ一般的なプロトコールではありません。かなりきれいになると思います。 それかキットがあるならそれでもいいですが（多分シリカなどに吸着させるようなものが出回ってるんだろうと思いますが）。

(無題) 削除/引用 No.8603-5 - 2020/01/29 (水) 10:05:47 - AP 同じデザインのPCRかかるときとかからないときがあるというなら、サンプルの品質がぶれているんでしょう。 ゲノムDNAだから、本来サンプルごとに極端に量や質がぶれるはずはないし、 ある程度の量と質があれば増幅は容易であるはず。 同じ条件できっちりふえるのと、増えが極端に悪いものがあるというのは、よほどの悪条件のサンプルがあるってことじゃないですか。 スクリーニングが目的でかかるのとかからないのがあって、かからないのは別仕立てのプロトコールで、というのはうまいやりかたではないでしょう。条件を検討して、同じプロトコールで一律にかかるようにするという方針がいいと思います。 材料は何で、どのようにDNAを調製しているのでしょうか。 PCRに使っている酵素は？　ダイレクトシークエンスでスクリーニングするのが目的なら、正確性よりクルードサンプルに強いやつがいいですよね。

(無題) 削除/引用 No.8603-4 - 2020/01/29 (水) 10:02:29 - PCR おお先生ありがとうございます。 実はこのトピックを立ててすぐにPCIで精製してみたんです。 具体的には、まずProK/SDSで2時間、55度で処理後にPCIしてエタチンしました。 それで行うと確実にですが、35サイクルでうっすら出るようになり、さらにそのサンプルからもう一度PCRをかけるとがっつり出てくれました。これでとにかく配列が読めそうです。 TaqでPCRをめちゃんこかけましたが、200bp程度なのでエラーはないものと期待したいです... 今回私が行なったPCI精製というのがおお先生の言われる精製のことでしょうか？ もっと簡便な方法というのはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8603-3 - 2020/01/29 (水) 08:32:17 - おお あ、あとね、嫌味言うわけではないけど３０サイクルくらいまででちゃんとバンドが出てほしいなと思う。

(無題) 削除/引用 No.8603-2 - 2020/01/29 (水) 08:27:01 - おお ゲノムのPCRはプライマーのよしあしにもよりますが、いい環境でないとかかりにくいものも結構あり前任、他のラボなどの人がワークしているのにわけがわからなくなってしまうとか言うことも結構あります。一つの原因になりうる要因はInputのDNA量で出にくいからといって更に量を上げるとほとんどかからなくなったとか。 このようなPCRは簡易な方法がありますが、もしやってなければまずはDNAを精製をして数十ナノグラムをPCRにかけるようにして、かかるようならより簡易な方法にしていくほうがいいと思います。簡易にしてかからないものも出てくると思いますがそれはそういうプライマーなので、簡易な方法で使わないようにすればいいです。またPCRの条件検討の際にはDMSOやベタインも一度は試しておくといいです。 ＞35サイクルほどでかろうじて見えるバンドの解釈としては、PCRがかかりにくいということでしょうか？ それは増幅されたものがスペシフィックであればそうだし、そうでなければノンスペでかからないということです。解釈を急ぎすぎです。 プライマーをR、Fで２こずつ設定しているのですから場合によってはNestedで特異的なものを拾うようにしてもいいでしょう。

PCRで35サイクルでうっすらと... 削除/引用 No.8603-1 - 2020/01/29 (水) 07:19:21 - PCR クリスパーキャス9である遺伝子のノックアウトを作製するためにいくつかの候補ガイドを作製して、編集効率をざっくりとサンガーシークエンスで見る予定でいます。 編集部位を含むようなPCR産物250bp程度を得られるようなプライマーをフォオワードで2つ、リバースで2つ合成し、4通りの組み合わせが出来るようなデザインにしたところ、そのうちの一つがワークしました。 そこでこのプライマーペアを使ってスクリーニングをしようかと思いましたが、PCRがかかる時とかからない時があり、非常にムカつきます。 みんなにお聞きしいますが、35サイクルほどでかろうじて見えるバンドの解釈としては、PCRがかかりにくいということでしょうか？そのうち部をとり、さらに35サイクルを回すとバンドはめちゃ強くなるものでしょうか？ お世話になります。

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