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(無題) 削除/引用 No.8601-19 - 2020/01/30 (木) 09:33:11 - ちき 個人的には、比をとるのは、当該タンパク質量が大きく変化しないという前提のもとで、よりよいinternal controlになるからというだけのことだと思っています。(比自体に生物学的な意味はない。) なお、権威主義的と思われるかもしれませんが、JBCの投稿規定のWB定量に関する記述の中で、特にreferenceや説明なしで以下の文があります。 Phospho-specific antibody signals should be normalized to total levels of the target protein.

(無題) 削除/引用 No.8601-18 - 2020/01/30 (木) 08:09:37 - F ウエスタンの定量を厳密にやろうと思ったら検量線が必要ですね。 バンド定量がタンパク量を正しく反映していると仮定した場合、リン酸化タンパクと非リン酸化タンパクの量の比の意義はどう考えますか？　上流のキナーゼの活性を推定したい場合、比を取る意味はありますか？　酵素反応で考えると、キナーゼと基質の乖離結合と、結合した基質のリン酸化の二段階になりますが、単純に非リン酸化基質とリン酸化産物のモル比を取っても、あまり意味がないかもしれませんね。KmとかKcatとか、詳しい方のご意見とか伺えると勉強になる気がします（他力本願です）。生物学的な意義ではなく、単にロードのバラツキ補正が目的であれば、ハウスキーピングで補正すれば良いと思います（バンドの強さがタンパク量をきちんと反映している前提ですが）。 下流への効果の推定ならば、リン酸化タンパク量で考える方が良い気がします。この場合、比で見る意味が（生物学的に）あるかどうか、疑問と思います。 個人的には、検量線なしのウエスタンで定量はしません。ロードのコントロールはレプリカで取る場合が多いです。気になるときは、ウエスタン後のメンブレンをアミドブラックなどで染めてチェックする場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.8601-17 - 2020/01/29 (水) 13:29:31 - asan >つまり、リン酸化タンパクのバンドの定量を行うにあたって、シフトアップしたバンドをまるごと測定してその値をp-○○/(p-○○+脱リン酸化○○)の比を性格に測定できれば問題はないということでしょうか？ それで満足するならそれでいいのでは？ 自分は問題ないとは思わないけどね。ブロッティングの原理上PAGEでバンドが物理的に広がるならばその時点で何の数字かは明確ではないので、もはや定量コントロールとしてどうなの？という指摘が上司ないしレビューワーからきて満足のいく反論ができるかどうか次第ではないかと。言い出したらポリクローナル抗体全てで言えるからキリがないけど。 ただし、そもそも、リン酸化量比を絶対トータルのそのリン酸化バンドに対して数字を取ることそのものに意味があるとも思えないので。 自分はwholeのWBのバンドも抗体で染めててリン酸化特異的に動いてますってざっくりブロットで示せてればそれ以上どうやろうが本質的ではないと思うので。

(無題) 削除/引用 No.8601-16 - 2020/01/29 (水) 13:12:11 - おおお 皆さま、ご返信いただきましてありがとうございます。 つまり、リン酸化タンパクのバンドの定量を行うにあたって、シフトアップしたバンドをまるごと測定してその値をp-○○/(p-○○+脱リン酸化○○)の比を性格に測定できれば問題はないということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8601-15 - 2020/01/29 (水) 09:47:22 - asan そもそも論として、HRPでかつ全くクローンの異なる抗体どうしの1点量比較でWBをやった場合において、ratioを出すことに厳密性はないので、筋が通ってる方法ならなんでもいいと思います。 2倍か3倍か議論したいなら別のより定量性の高い手段を取らないと厳密なことは言えないので、レビューアーが納得するかどうかは別にしてもかなり大雑把な議論だと思った方がいいです。 WBでトータルタンパク量が変わってないことはローディングコントロールで示すのが慣例でしょうが、リン酸化変化を示す場合にトータルリン酸化量自体が変化してないかそれ自体が増えてないことは示せたとしても、それでratioをとったから定量的でratioを取らねば定量的でないという議論には違和感があります。慣例としてやるのであれば、バンドシフトして分離したならばnon phosphoと思われるバンドだけをこのトロールにするのか、全体を括ってしまうのかは主観にもよると思いますが、前提として全体の出方はほとんど変わらないからコントロールとして成立してると思うので、バンドの形がサンプル間で大きく変わったら正直何を見てるかわからないという上司の指摘には個人的には納得します。 正解はないので論文の趣旨によっては擬似定量なので何も言われないと思いますよ。でも2倍か3倍か厳密な議論をしだすと、こんな定量値は（原理上）厳密じゃない、ってレビューで突っ込まれたりした人もいます。

(無題) 削除/引用 No.8601-14 - 2020/01/29 (水) 02:56:34 - おお ＞リン酸・脱リン酸タンパクを検出する場合、リン酸修飾によってバンドのシフトアップが生じてしまうことから、正しく測定できていないのではというものです。 いまだこれがよくわからない。 リプロービングの場合は弱いシグナルがでる方を先にやる。ストリッピングをやるには特に同じ種の抗体ならリプロービング後２次抗体だけで検出して十分抗体が剥がれてるか確認すると確実。抗体の特異性がつよい抗体でストリッピング後に検出するならつよりストリッピングバッファーを強力にすればやりやすいです（たとえば４M以上のグアニジンとか）。 リン酸化とTotal（リン酸化と非リン酸化の合計）の比ですが、まあたいていそれでいいかもしれません。でもTotal（リン酸化と非リン酸化の合計）が４倍増えてて、リン酸化が３倍増えてたらどうしますか？ まずはInternal control（アクチンとかGAPDH）またはLoadingタンパク量ベースでリン酸化とTotal（リン酸化と非リン酸化の合計）の量を出してからリン酸化とTotal（リン酸化と非リン酸化の合計）の比を取るのか決めたほうがいいのかなと思います。まあ、Total（リン酸化と非リン酸化の合計）が変動してたらその時点で気がついてどうしようかってなると思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.8601-13 - 2020/01/28 (火) 18:02:49 - sdfcgvbhjんk リプロービングで検出すべきものは全当該タンパク質です。すなわちリン酸化されたものもされていないものも両方認識する抗体を使います。抗原決定基がリン酸化される部位とは異なる抗体です。もし脱リン酸化フォームのみを検出したいならば、市販品はあまりないと思うので、そういう抗体を作らなくてはなりません。

(無題) 削除/引用 No.8601-12 - 2020/01/28 (火) 17:56:39 - ちき かぶりました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.8601-11 - 2020/01/28 (火) 17:55:37 - ちき > →ローディングコントロールというとダルト数を示すポジコンということでしょうか？ 正しくレプリカになっていることを示すために、2枚のフィルターを今注目しているのとは別の抗体で反応検出するということです。そのシグナル強度で、注目しているタンパク質のシグナルを補正することになります。 ダルト数とはダルトン(統一原子質量単位)のことでしょうか。だとすれば、違います。それは分子量マーカーですね。 > ＞＞なお抗体の入手可能性にもよるでしょうが、リン酸化/非リン酸化比よりも、リン酸化/当該タンパク質全体比を測定するほうが一般的と思います。 > →論文等ですとp-〇〇/○○ ratioが多いように見受けたので、確認してみます。 その○○は非リン酸化型特異的な抗体によるシグナルですか。それともリン酸化にかかわらず検出する抗体のシグナルですか。前者の場合は非常に少ないと思いますが。(利用できる抗体が少ないので) なお、蛍光ウェスタンの道具があれば二重染色がスマートだとは思いますが、いずれにしろ違う動物種の抗体を使わないといけないので、化学発光で抗体をはがさずにH2O2でHRPを失活させてリプローブする方法もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.8601-10 - 2020/01/28 (火) 17:48:49 - tts ・タンパクの検出方法はリプローブとクローンメンブレンのどちらを用いるかは実験者の好みが大きい様に思います。 私はリプレゼンタティブにはクローンメンブレンで測定していますが、それ以外では場合によりけりです。 リプローブだと、H2O2を用いた場合にはHRPの不活性化が出来ているか、あるいは還元剤を用いた場合には抗体のリッピングが出来ているか、を検討しないといけないので、何かと手間で、あまり好みではありません。そのため基本同じ位置にバンドが出ることになるリン酸化体とtotal体をリプローブでは見ません。 リプローブは、むしろ分子量が明確に違うサンプルを検出する場合に用いています。 ・検出したバンドの定量は他の皆様も記載されているとおり「p-○○/total-○○」が一般的ですね。 学会レベルのデータだと「p-○○/house keeping protein」のデータを出しているグループも時々見かけます。 リン酸化、非リン酸化の比が重要であれば「p-○○/[p-○○+非リン酸化体-○○] = xx%、非リン酸化体-○○/[p-○○+非リン酸化体-○○] = yy%」でデータ整理したりもしますね。

(無題) 削除/引用 No.8601-9 - 2020/01/28 (火) 17:21:36 - AA リプローブを認めるかどうか、については結構流儀の問題な気はします。 先生方によっては、剥がれ残りや白抜けなどが生じうる以上、 リプローブ前後では異なるメンブレンであると考えるべきという人もいます。 実際、リプローブ条件設定に苦労されるひとも少なくないように思いますので 個々の経験次第なのではないでしょうか。 ただ、バンドのシフトアップを原因にレプリカを用意して比較しないと、というのはイマイチしっくり来ません。 すでに指摘のある通り、シフトアップ分も含めて定量すれば良いです。 リン酸化関係なしに目的タンパクへ反応する抗体であれば、シフトアップした分も内包したブロードなバンドになるはずです。 ちなみにバンドシフトということではゲルの方で工夫して使って思いっきりバンドシフトさせてバンドを分離して定量する方法もあるようです。 phos-tagという方法で広島大で開発された手法のようです。

(無題) 削除/引用 No.8601-8 - 2020/01/28 (火) 17:05:13 - おおお asan様　ご回答ありがとうございます。 ＞＞リプローブすると前の抗体の不活化が不十分だったりする可能性もあるので普通それをどうしてもやりたければ蛍光2次抗体などで2重染色の方がいいと思います。また、リン酸化抗体によってはリブロットすると抗体が剥がれないのか、白抜けする抗体もあります。基本的に同じメンブレンでみれればベターですが、1枚で全てのタンパク質を見ることなど不可能なので、等量のサンプルをアプライしてレプリカを作ればOKとみなすのが一般的だと思います。 →二重染色について、承知しました。詳しく調査してみます。 等量の〜・・・について、二枚で見ることも一般的だと思うのですが、私のラボではリプロービングをするのが当たり前という風潮があります。その考えになるのは一体何が原因なのでしょうか。 ＞＞そもそも論として、バンドシフト以前の話として異なる抗体のブロットから量比を比べるのはあまり厳密ではありません。 →私の知識不足で申し訳ありませんが、p-○○/house keepingが一般的ということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8601-7 - 2020/01/28 (火) 16:58:57 - Ryo+Koizumim TS様　ご回答ありがとうございます。 ＞＞分母にするのはリン酸化と脱リン酸化されたタンパクの両方の総和ですね。 たいがいの抗体はそのように設計されているのでは？ →p-〇〇/○○ ratioをおっしゃっているのでしょうか？ それともp-○○/house keepingということでしょうか？私の理解不足で申し訳ありませんが詳しく教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8601-6 - 2020/01/28 (火) 16:51:38 - Ryo+Koizumim ちき様　ご回答ありがとうございます。 ＞＞またゲルを二枚に分けたら、それぞれのローディングコントロールも必要になるでしょう。 →ローディングコントロールというとダルト数を示すポジコンということでしょうか？ ＞＞なお抗体の入手可能性にもよるでしょうが、リン酸化/非リン酸化比よりも、リン酸化/当該タンパク質全体比を測定するほうが一般的と思います。 →論文等ですとp-〇〇/○○ ratioが多いように見受けたので、確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.8601-5 - 2020/01/28 (火) 13:38:40 - asan >私の知識ではリン酸化タンパクを検出後、同様のメンブレンをリプロービングすることで脱リン酸タンパクを検出し、ratioとして数値化するものだと思っておりました。 リプローブすると前の抗体の不活化が不十分だったりする可能性もあるので普通それをどうしてもやりたければ蛍光2次抗体などで2重染色の方がいいと思います。また、リン酸化抗体によってはリブロットすると抗体が剥がれないのか、白抜けする抗体もあります。基本的に同じメンブレンでみれればベターですが、1枚で全てのタンパク質を見ることなど不可能なので、等量のサンプルをアプライしてレプリカを作ればOKとみなすのが一般的だと思います。 ＞ご指摘いただいた内容として、同様のダルト数（kDa）のリン酸・脱リン酸タンパクを検出する場合、リン酸修飾によってバンドのシフトアップが生じてしまうことから、正しく測定できていないのではというものです。 そもそも論として、バンドシフト以前の話として異なる抗体のブロットから量比を比べるのはあまり厳密ではありません。Kd値が違うもの同士でレシオを取ること自体が大雑把な話だと考えたほうがいいです。検量線があるならともかくですが、、、。

(無題) 削除/引用 No.8601-4 - 2020/01/28 (火) 12:59:47 - TS あ、勘違いがありました。ちきさんがおっしゃる通り、分母にするのはリン酸化と脱リン酸化されたタンパクの両方の総和ですね。 たいがいの抗体はそのように設計されているのでは？

(無題) 削除/引用 No.8601-3 - 2020/01/28 (火) 12:58:09 - TS ＞私の知識ではリン酸化タンパクを検出後、同様のメンブレンをリプロービングすることで脱リン酸タンパクを検出し、ratioとして数値化するものだと思っておりました。 これは一般的ですね。Totalへの抗体による検出を省略してしまうことも場合によってはあると思いますが。うまいリプローブが難しければ2枚のメンブレンを使うのもありえます。 ＞しかし、ご指摘いただいた内容として、同様のダルト数（kDa）のリン酸・脱リン酸タンパクを検出する場合、リン酸修飾によってバンドのシフトアップが生じてしまうことから、正しく測定できていないのではというものです。 これはどういう意味でしょうか。位置がずれても検出されていれば、面積に含めればよいのではないですか。Total用の抗体がリン酸化フォームを認識できるのか、リン酸化抗体がすべてのリン酸化フォームを検出できるものかはわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.8601-2 - 2020/01/28 (火) 12:57:55 - ちき なぜシグナルがシフトすると正しく測定できないことになるのか、そのロジックがわからないです。またゲルを二枚に分けたら、それぞれのローディングコントロールも必要になるでしょう。 なお抗体の入手可能性にもよるでしょうが、リン酸化/非リン酸化比よりも、リン酸化/当該タンパク質全体比を測定するほうが一般的と思います。

リン酸化タンパクのWBについて 削除/引用 No.8601-1 - 2020/01/28 (火) 12:45:52 - Ryo Koizumim お世話になっております。 現在リン酸化タンパク質の検出をWBにて行っております。 研究室の上司からご指摘をいただいたものの、私の知識不足でこちらで質問させていただきました。 内容はリン酸化タンパク質のWBでの検出のデメリットについてです。 私の知識ではリン酸化タンパクを検出後、同様のメンブレンをリプロービングすることで脱リン酸タンパクを検出し、ratioとして数値化するものだと思っておりました。 しかし、ご指摘いただいた内容として、同様のダルト数（kDa）のリン酸・脱リン酸タンパクを検出する場合、リン酸修飾によってバンドのシフトアップが生じてしまうことから、正しく測定できていないのではというものです。 その場合、ゲルを二枚使用し、同サンプルをアプライして検出する必要があるのではとのことでしたが、論文ではリプロービングによって多くの方がリン酸・脱リン酸タンパクを検出しています。 そこで、どちらが正しいのかわからなくなってしまったのでご教授お願いいたします。

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