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(無題) 削除/引用 No.860-10 - 2012/08/26 (日) 05:03:13 - おお 最近WBの検出感度がよくなっているせいか、異種IgGでIP、WBしてもIgGがひっかかったりしますね。マウスようLight Chain specificはいいものがあり50-70あたりのものなら使ってみる価値がありそうです。 そのほかてはなきにしもあらずですが、結構煩雑になったりですねぇ。レジンにクロスリンクさせた抗体でIPとか。 際どいやり方だと二次抗体で反応させる時にラビットニュートラルIgGをちょっと加えノンスペを吸収させるというても取れますが、あまり真剣に取り組んだことがないせいか、これというコンディションは持っていません。

(無題) 削除/引用 No.860-9 - 2012/08/25 (土) 18:59:17 - (゜Д゜ 抗体クロスリンクしても100パーじゃないんでやっぱ少しははずれるよ。クマシなら見えないかもしれないけどウェスタンだとやっぱそれなりにまだ結構強く出るわ。ツルブロトはいいかもしれない。それかウェスタンの抗体をIPの抗体と違う動物種の抗体にしてやればどうよ。おなじIgGだから量が多ければ多少出るかもしれないけど、いまよりはずっとましと思うが。

(無題) 削除/引用 No.860-8 - 2012/08/25 (土) 10:33:26 - qq ＞目的蛋白は46kDaなのですが、50kDaとうまく分離できますでしょうか…。 ＞50kDaは非常に強いバンドなのですが…。 抗体の量を減らすか、細胞タンパクの量を増やすのも一つの選択肢になります。 ところで、IPで使う抗体は、抗原アフィニティーで精製してありますか？ 抗血清だったりproteinA精製の抗体だと、IPにはちょっと難しいかもしれませんね。 ＞今は10%ゲルで泳動していますが、何%位が適切でしょうか？ 泳動フロントに30kDaがくる程度のゲルが良いかもしれません。 IPできていることをとにかく示したいときに、細胞を35S-Metで標識したあとで免疫沈降してSDS-PAGEのゲルをフルオログラフィーで検出という方法も古典的ではあります。、、が、RIなので今は誰もやらないかもね。

(無題) 削除/引用 No.860-7 - 2012/08/24 (金) 11:45:14 - ~ >二次抗体だけでウェスタンブロッティングすればよいという事ですね。 よいといいますか、断定的に書かれている情報には根拠があるだろうと推測したのですが、そういうデータがあるわけではなかったのですね。 たとえばTrueBlotで問題が解決するのは二次抗体がIP用抗体と結合する場合であり、一次抗体が結合していた場合は解決できません。 まだやっていないのであれば、今から予備検討をやるよりもTrueBlotを買った方が効率がいいと思いますが、手持ちのデータでどこまで分かっているのかは把握しておいた方がいいでしょう。 >今は10%ゲルで泳動していますが、何%位が適切でしょうか？ 濃度よりも長さで分けることになるかと思います。 たとえばシークエンシング用の66cmゲルを持っていて、それを使えば分離ができて実験が進められるの場合、 検出できないために実験をあきらめるよりも、それを使って実験を進めた方がいいでしょう。 >Disulfide型IgG用の二次抗体というのは、Trueblotというやつでしょうか。 はい。 ただ、TruBlotは普通の二次抗体と比べてシグナルが極端に低くなる（1/3~1/10位？）ので、きちんとシグナルが出るかは心配ですが。

(無題) 削除/引用 No.860-6 - 2012/08/24 (金) 11:12:51 - IP夫 なるほどー。light chain specific antibodyも確かに売ってますね。 とても参考になります。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.860-5 - 2012/08/24 (金) 11:00:19 - カイ ブロットにlight chain specificの二次抗体を使うとか、IPをする際にクロスリンクするかですかね。 どちらも感度は下がりますが。

(無題) 削除/引用 No.860-4 - 2012/08/24 (金) 10:55:13 - IP夫 返信ありがとうございます。 コントロール、ですか・・・。 レーンは、IPに使った、normal rabbit Igと二種類の蛋白に対するrabbit由来抗体の3レーンだけです。 その全てで同じように25kDaと50kDaにバンドが出ています。 一次抗体が反応しているという可能性は考えていませんでした。ということは、一次抗体を入れずに、二次抗体だけでウェスタンブロッティングすればよいという事ですね。 目的蛋白は46kDaなのですが、50kDaとうまく分離できますでしょうか…。50kDaは非常に強いバンドなのですが…。今は10%ゲルで泳動していますが、何%位が適切でしょうか？ あと、Disulfide型IgG用の二次抗体というのは、Trueblotというやつでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.860-3 - 2012/08/24 (金) 10:38:15 - ~ >何故、anti-mouse IgGなのにrabbit Igに反応しているのでしょうか？ この質問が出るということは、一次抗体ではなく、二次抗体がrabbit IgGに結合しているという結論が出せるくらいのコントロールは置いているのですよね。 得られている結果はきちんと説明しないと、今の時点で何がわかっているのかが他人に伝わりません。 原因追及でではなく問題解決に近づきたいのであれば、 ・移動度で分ける 　抗体と目的タンパク質が分かれるような泳動をする。 ・目的のタンパク質のみ認識するようにする 　Disulfide型のIgGのみを検出する免疫沈降用の二次抗体を使い、IPで使用した抗体はメルカプトエタノールで還元することで検出しないようにする。 といった対処療法で実験を進めては？

(無題) 削除/引用 No.860-2 - 2012/08/24 (金) 09:05:00 - qq いろいろなコントロールをとっていますか？ 全てのコントロールのレーンは、どのようなブロットになりますか？ 「コントロールさえあればOK」では全くないのですが、コントロールから判ることがたくさんあります。

50kDa蛋白の免疫沈降でIgGと重なって困っています！ 削除/引用 No.860-1 - 2012/08/23 (木) 20:35:58 - IP夫 50kDaの蛋白をマウスの細胞からIPしています。 IPで使った抗体はrabbit由来のもので、Westernに使った二次抗体はanti-mouse IgGにも関わらず、50kDaと25kDaにIgGのバンドが濃く出てしまい、IPがうまくいっているかが分かりません。 何故、anti-mouse IgGなのにrabbit Igに反応しているのでしょうか？使っている二次抗体は、GE Healthcare社のNA931で、rabbit Igには反応しないと書いてあります。 とても困っています。 どなたかよろしくお願いします。

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