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(無題) 削除/引用 No.86-11 - 2012/01/28 (土) 01:55:18 - 反リア充 両者は基本的に蛋白質には実験処理過程で全然違う事起きてるのだから、結果の整合性がどうこうというのは、原因究明はやっぱむずかしいし、また今それをはっきりさせないと進めないとも思えないし、とりあえずいいじゃね、みたいにおもう。。可能性あげればきりないと思うけど、例えば、たまたまシステインが多いとか偏りがあるとかの蛋白質で、SDSで変性したとき、分子間にランダムなジスルフィド結合とか形成されてそれがたまたまN末側への抗体のアクセスに不都合で非還元条件では上手い事見えなかったのかもしれないし。天然状態ではちゃんとアクセス出来るけど、みたく。 それより、特異性とか大丈夫かな？IFで見えるというやつは本当にその蛋白質かな？ウェスタンは分子量とかのインフォメーション動員すれば、ある程度察しがつくけど、IFとかだど、分かんないしなあ。

(無題) 削除/引用 No.86-10 - 2012/01/27 (金) 17:31:48 - お粗末君 non-reducedのサンプルに２−MEを加えた場合と、抽出の時点で２−MEが入っている場合では失活する酵素や抽出される分子が異なるため聞いたのですが、ラフトを分けてた後でも検出できているとの事なのでタンパクが変性した為では無さそうですね。すると非還元では可溶化が十分ではなくゲルに入っていないことも考えられます。 質問内容を見直したのですが、WBでは立体構造について議論はできないので知りたければ相応しい手法をもって調べる必要があります。どれだけ重要なデータになるのか考えて進める事をお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.86-9 - 2012/01/27 (金) 15:19:40 - ど素人 >膜タンパク質という前提で考えていますがよろしいいでしょうか。 欲しい情報としては 全長に対する抗体のIFAと染色パターンは同じか。 膜透過処理をしたものではどうか。 PFA固定に耐えるエピトープか。 WBでnon-reducedとreducedの抽出法は同じかです。 シグナル配列、膜貫通領域はありませんが、目的分子を分画させると、脂質ラプトの分画にシグナルが検出されたので、膜タンパク質なのでしょう。 シグナル配列、膜貫通領域がないのと既報から、細胞の膜状の構造に複合体として存在しているようですが、膜に直接アンカーしてはいないみたいです。 全長に対する抗体は、相同性の高い分子と交差反応するため、IFAには用いていません。全長に対する抗体も使えれば、もっと比較検討できるデータも出たのでしょうが・・・。 IFAの説明が足りていませんでした。膜透過処理したら点状のシグナルが検出されました。膜透過処理をしなければ、バック程度のシグナルしか見えません。 non-reducedとreducedの抽出法は同じです。違いといえばメルカプトエタノールを加えているかいないかぐらいです。

(無題) 削除/引用 No.86-8 - 2012/01/27 (金) 09:27:35 - お粗末君 膜タンパク質という前提で考えていますがよろしいいでしょうか。 欲しい情報としては 全長に対する抗体のIFAと染色パターンは同じか。 膜透過処理をしたものではどうか。 PFA固定に耐えるエピトープか。 IFAが正しいと仮定すると生でも認識できるはず。 可溶化や分解、修飾変化を考慮に入れると WBでnon-reducedとreducedの抽出法は同じかです。

(無題) 削除/引用 No.86-7 - 2012/01/27 (金) 08:35:00 - Harmonia そのタンパク質は分泌タンパクで、細胞染色だとプロセス前のものがN末抗体で見えるけど、ウエスタンだと（N末部分はフォローされないので）見えないとか？ って思ったけど、条件次第でウエスタンで見えているんですね。 固定方法の違い、っていう、よくある逃げ口上で済ます？

(無題) 削除/引用 No.86-5 - 2012/01/26 (木) 23:41:46 - ど素人 IFAは固定した後に染色しましたか？また、ネガコンはどのようなものですか？＞ PFA固定後、染色しました。ネガコンは、免疫前の血清を一次抗体に用いたものです。 ちなみにWestern Blottingでは、全長に対する抗体を用いたときは、reduced/non-reducedにかかわらず、バンドが検出されています。

(無題) 削除/引用 No.86-4 - 2012/01/26 (木) 17:57:48 - お粗末君 ＞reducedの条件でのみシングルバンドが検出されました。 IFAは固定した後に染色しましたか？また、ネガコンはどのようなものですか？ もしその抗体が疎水領域など正しい立体構造をとっている分子を認識できない場合、 生の細胞では認識できない可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.86-3 - 2012/01/26 (木) 12:00:11 - う 一応確認ですが、 ＞reducedの条件でのみシングルバンドが検出されました。 調整法が異なるサンプルでウエスタンをしたということですから、 その条件の違いによって、何か「物理的に」違うことが無かったかと 想像してみて下さい。 例えば、一方のサンプル調整中に、遠心したりしたとき、 不可溶なタンパク質とかの沈殿が多かったとか。 ウエスタン用のサンプルは「溶液」ですので、 どこかのステップで細胞内のタンパク質をロストしている可能性は 考えられないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.86-2 - 2012/01/26 (木) 08:27:49 - Harmonia 用いる変性剤によって立体構造が変わる＝＞エピトープの露出ぐあいが変わる＝＞抗体に認識される度合いがかわる。 とか。 その抗体で検出されていないときに、メンブレン上にタンパクが存在していない。 とか。

N末に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析 削除/引用 No.86-1 - 2012/01/26 (木) 02:40:56 - ど素人 あるタンパク質のN末領域に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析で、 reducedの条件でのみシングルバンドが検出されました。 また、IFA解析で同じ抗体を用いて局在解析したところ、全ての細胞でポジコンに対し規則的な点状のシグナル(ネガコンとは異なるので、非特異的なシグナルではないと思います。)が検出されました。 この結果の考察に悩んでいます。 ウェスタンブロットの結果からは、N末領域が内包されるなどの立体構造をとっていることが考えられますが、IFAの結果を鑑みるとそうではないようです。 これは、一体どういうことでしょうか。 ウェスタンブロット等に詳しくないので、どなたかご教示ください。

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