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(無題) 削除/引用 No.8597-15 - 2020/01/29 (水) 21:44:35 - めんせん くぁうぇsdrgt６７様 今日、AF488以外のの蛍光色素で染めてみたところ、非特異的な染色が目立たなくなりました！今回は本当に勉強になりました。心より御礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.8597-14 - 2020/01/28 (火) 12:50:04 - くぁうぇsdrgt６７様 好中球は強い自家蛍光を呈する場合があります。好中球はその顆粒構造の膜にNADPH-oxidaseという、スーパーオキサイドを産生する酵素を豊富に持っていますので多分NADPHとかが自家蛍光の主な原因かもしれません（Monsei A et al Plos One 9(3) 2014)。FACSのマニュアルで注意点として見かけたことあります。 そのほか皮膚とうことですと健常者でも高齢者のサンプルなどではAGE（非酵素的糖化産物）に起因する自家蛍光を示すことがあるので注意した方がいいです。

皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.8597-13 - 2020/01/28 (火) 10:20:40 - めんせん くぁうぇsdrgt６７様 何度もsuggestion頂きありがとうございます。自分の染めている組織はヒトの皮膚で、パラフィン標本をCitrate Bufferでオートクレーブして抗原賦活しています。CD4, CD8はそれで良く染まるのと、目的の分子に対する抗体のdatasheetでもCitrate Bufferで抗原賦活と書いてあったので、抗原賦活はそれでOKかなと思っておりました。今回の非特異的な染まりは、バックグラウンドというよりも、顆粒球のように核が分葉している細胞の細胞質にくりっと染まるのが不可解で（その分子は顆粒球には出ていないので）、何となくですが顆粒の成分の自家蛍光なのかなと思っていました。今日、別の蛍光標識の二次抗体で染色してみるのと、念のため二次抗体無しのコントロールも免疫染色してみようと思っています。あとは、ご指摘の通り凍結切片で行うか、酵素抗体法かなと考えております…ご親切に回答くださり、ありがとうございます！ Orange様 確かに、二次抗体２００倍は若干濃いめなので（今まであまり問題になったことはなかったのですが）、５００倍とか１０００倍でも試してみたいと思います。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.8597-12 - 2020/01/28 (火) 07:28:21 - 奈緒推し Why you can not write English?

(無題) 削除/引用 No.8597-11 - 2020/01/28 (火) 06:29:24 - Orange motto yokuarauka, kishakuwo motto surunoha doudeshouka? 200 bai ha koi kamo? I can't write Japanese, sorry!

(無題) 削除/引用 No.8597-10 - 2020/01/27 (月) 23:26:53 - くぁうぇsdrgt６７ リポフスチンは老人脳など特定の組織では自家蛍光の原因となり得ますが、そうどこにでもたくさんあるものではないので、できれば組織についての情報を書いてもらえたらと思います。どこにでもありそうなものとしては酵素結合型のNADやFADが緑色の自家蛍光を呈します。また大動脈のエラスチンなども強い緑色の自家蛍光を示します。糖尿病をはじめ一部の疾患で見られるAGEsのようなグリケーション産物も蛍光を呈するものがあります。 いずれも自家蛍光が問題になるかどうかは抗体由来の蛍光強度との相対的な兼ね合いに左右されますので、抗体由来の蛍光強度が十分に強ければ、自家蛍光は目立ちませんが、抗体由来の蛍光があまり強くないと、特に、画像調整して蛍光を強めると目立ってきます。抗体濃度や反応時間、固定条件（特に時間）、凍結切片の使用、など一般的な免疫染色の条件も検討することも検討ください。あと抗原賦活はしているでしょうか。していないならば検討ください。パラフィン切片の場合、しないと、上手く染まらない場合がとても多いです。その他、アビジン-ビオチン法などを使うことでシグナルの増感をすることもできるのでそういった改良も検討ください（この場合は内在性ビオチンのブロックも忘れないように）。 どうでもいいことですが、8597-８の人のいうリボフラスチンはリポフスチンの誤りと思います。察するに、全く別の分子ですが似たような名前でリボフラビン（ビタミンB)があってこれも自家傾向を呈するので, 両者を混同してリポフスチン＋リボフラビン＝リポフラスチンになったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8597-9 - 2020/01/27 (月) 08:11:19 - はい >[Re:8] monさんは書きました : > リポフスチンじゃなくてリボフラスチンな いやいや、前者で良いでしょう。むしろ後者は聞いたことすらない

(無題) 削除/引用 No.8597-8 - 2020/01/27 (月) 03:30:55 - mon リポフスチンじゃなくてリボフラスチンな

(無題) 削除/引用 No.8597-7 - 2020/01/26 (日) 21:59:57 - めんせん F様 コメントありがとうございます！自分はもう少し蛍光染色で粘ってみたいと思っているのですが、緑色でも赤色チャンネルでも自家蛍光が出てきそうであれば、もっと遠い波長の標識だとまだましなんでしょうか？CD4とCD8はAF647で染めていて、DAPIも使っているので、PEもダメかもとなると、AF750とかでしょうか。また、本当に自家蛍光かどうか調べるために二次抗体なしのサンプルも次回はおいてみようと思いました。いろいろ勉強になるsuggestionありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.8597-6 - 2020/01/26 (日) 21:22:32 - F 自家蛍光であれば、CD4やCD8の染色でも見られるはずですが、どうでしょう？　もしCD4/8の染色もFITCやAF488でなさっているのであれば、分葉した核を持つ（核の形態だけで顆粒球と判断できる）細胞も自家蛍光で陽性になると思います。CD4/8を他のカラーで染めているのであれば、その標本をFITCチャネルで見れば、自家蛍光か判断できると思います。 マクロファージの研究をやってますが、緑色自家蛍光だけが高いマクロファージはあまりないと思いますよ。緑色の自家蛍光が高いマクロファージの場合、赤色でも高い場合がほとんどかと思います。リポフスチンなど、蛍光スペクトルがかなりワイドな自家蛍光物質があると思うので、自家蛍光だった場合はチャネルの変更だけでは難しいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8597-5 - 2020/01/26 (日) 12:47:51 - めんせん くぁうぇsdrgt６７様 コメントありがとうございます！やっぱり、緑は免疫染色でも自家蛍光が出やすいのですね…フローサイトで緑はマクロファージなどに自家蛍光が強く出るのは知っていたのですが、免疫染色でもとは知りませんでした。こういうことって、その辺の教科書にも乗っていないし、実際実験されたことのある方しかわからないですよね。本当にありがとうございます。早速違う色素で試して見たいと思います！

(無題) 削除/引用 No.8597-4 - 2020/01/26 (日) 11:57:22 - くぁうぇsdrgt６７ 土曜日から実験ごくろうさまです。免疫組織染色では組織によっては緑系は自家蛍光でることはよくしられています。これがまた一見いかにもきれいで本物ぽくみえることもあるので気をつけましょう。１次抗体2次抗体ともになしでどうなるかもみてほしいです。で原因は実験工程や抗体じゃなくて自家蛍光かなあとおもうので標識色素を緑じゃなくて赤とか青に変えること勧めます。赤や青も組織によっては自家蛍光を呈することはあるけど、緑系よりはその頻度は少ないです。最近は自家蛍光を抑える試薬も市販されているので調べて必要に応じて試してもいいとおもいます。 自家蛍光問題でどうにも鬱陶しい時は、酵素抗体法に変えることも検討することを勧めます。これはこれで気をつける点はあるけど、所定の前処置をすれば問題回避できるし、感度が高いし、酵素抗体法でも多重染色はできます。

(無題) 削除/引用 No.8597-3 - 2020/01/26 (日) 09:59:50 - めんせん mon様 コメントありがとうございます。実は、新しく買った抗体はInvitrogenのF(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488なのですが、これでも非特異的に染まってしまうのです…こんなことははじめてで、どうしたものかと悩んでおります。

(無題) 削除/引用 No.8597-2 - 2020/01/25 (土) 23:30:06 - mon 二次抗体を(Fab)2にする

anti-mouse FITCの二次抗体が非特異的に染まります… 削除/引用 No.8597-1 - 2020/01/25 (土) 21:32:33 - めんせん いつも参考にさせていただいております。 ヒトのパラフィン組織の免疫染色をしているのですが、何度やっても２次抗体のみのコントロールでも非特異的な染まりが出てしまい、困っています。 一次抗体はmouse由来で、二次抗体はGoat由来のanti-mouse抗体なのですが、二次抗体のみのネガティブコントロールでも、ある細胞にくりっと染まってしまいます。二次抗体を他の会社の製品に変えてみたのですが（FITC→AF488)やはり同様の非特異的な染まりが見られました。 具体的には、リンパ球に発現している分子なのですが、顆粒球らしきものに二次抗体が非特異的に結合しているようです。ちなみに、同時に別の抗体で染めているCD4やCD8はきれいに染まるので、抗原賦活を含め免疫染色全体の流れとしては問題はなさそうです。顆粒球系の細胞に二次抗体が結合しやすい、もしくはFITCだと自家蛍光（FACSの場合はあり得る気がしますが、免疫染色でも？？）が出やすかったりするのでしょうか？いつも二次抗体は２００倍希釈で常温３０分でインキュベートしており、これまであまり大きな問題は生じなかったのですが…。 知識不足で申し訳ありませんが、どなたかお知恵を授けていただけると幸いです。

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