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(無題) 削除/引用 No.8596-12 - 2020/01/30 (木) 10:02:37 - おお 加えておきますが、もしTransferしたあとのゲルやメンブレンの蛋白をCBBやぽんぞーで染めてなかったら、いろいろ試したときTransferの具合を見ておけばいいです。わたしもそうやってきたのであれこれと書けるというところがありますし、自分でもどうやって対処するかわかってきたところもあります。 そうそう、蛋白を効率よくゲルから出すにはゲルの厚さは薄いほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.8596-11 - 2020/01/29 (水) 17:36:20 - くぁうぇsdrgt６７ 250KDaのタンパク質は抽出時にうまく可溶化できてない、（つまりもしかすると分析試料中にほとんどない）、のかもしれない。Lysis bufferは何ですか。Lysis bufferをより強いものにしたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8596-10 - 2020/01/29 (水) 03:21:19 - おお フルメンブレンという指摘は最もなんだが、250kDaのいままでキャラクタライズされたものを調べているという観点からは250kDaを注目すればいい（プロセッシングなどで違う分子量に検出できるという今までの報告がない限り）。ただし自身で一度やっておくのはいいことだと思う。問題はいままでなんらプロセッシングなどの報告がないのに１００KDaにバンドが出たといった場合プロセッシングの過程など突き止めないと、何ら主張ができないのも事実。それですら、そういう結果になるというのは科学的なステップとして重要なのは事実ですけど。 なのでフルメンブレンで見ろとわたしはちょっと強く言えない。いままでどういうデーターを蓄積していて（ラボれべるとか、他の同様の研究をしている人たちレベルで）、なんに注目しているのかわからないから。 ２５０kDaは確かに大きいのでTransferの効率など気になります。ただ、もしポジコンになると思えるものがないなら、いくらやっても検出できなくって結論が出ないということになるかもしれません。みたいサンプルにおける発現量、蛋白抽出の改良の余地なども見落とせないファクターですから。 テクニカルにはいろいろな工夫ができます。ゲルの濃度。65、42kDaもみたければ８％程度でしょうけど、５％ぐらいにして単独で見るてもあります。またはグラジエントゲルをつかうとか。プレキャストげるなら高分子用のTris Acetateのバッファーシステムもあるようです。 Wetかセミドライかというと前者のほうがよりいいですが、セミドライで４００や３００kDaの蛋白を検出していたことがありますので、だめとまで言いません。Wetなら２０VぐらいでO/NでTransferすると高分子もかなり効率よくTransferできます。 高分子でTransferで工夫できるのはその他に、微量のSDSをいれる（これはやったことないし、Membraneとの相性や、メーカーによって言われていることがバラバラなのでちょっとはっきりしたことがいえません）、めたのーるを下げる。３００kDaたんどくなら５％ぐらいまで下げてもいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8596-9 - 2020/01/28 (火) 18:00:15 - ｓ 皆さん様々なご意見、ご指摘ありがとうございます。 セミドライ式で転写を行っております。 一度フルメンブレンでWestern blotを行います。

(無題) 削除/引用 No.8596-8 - 2020/01/28 (火) 15:36:24 - AA >>膜全体を最初は染めてみろ これには強く同意します。 指摘の通り、分解産物が下の方にあるかもしれませんので、トラブルシュートの点からも必須です。 また、切り取った部分だけ見せるのは「他は見せられないレベルなんだな」という印象になります。 文面からは高分子量なので転写が問題かも、という印象になりますが、おそらく質問者さんもそう思われているからの文章ではないかと思います。 サンプルが少ないのかもしれませんが、少なくとも条件が設定できるまではきちんとやるべきです。

(無題) 削除/引用 No.8596-7 - 2020/01/28 (火) 13:36:54 - あいみょん 250 kDaとなるとでかいからねぇ。 他の人が言ってる通りに、長めに通電、SDS添加、セミドライからウェット式 に変えてみてもだめなら、もっと根本的な理屈だと思いますね。 もともとタンパクがないとか、調製してる間に分解されてたりね。

(無題) 削除/引用 No.8596-6 - 2020/01/26 (日) 12:18:47 - くぁうぇsdrgt６７ 抗体には問題なく、電気泳動やblottingに基本的なミスがないということでしたら以下のような改変、検討でうまくいくとおもいます。ただ250k以上は大きすぎて転写がどうしても不完全になりやすく、とくに量の少ない蛋白質では再現性とか比較定量がなかなか難しいことがあります。その点も留意ください。 解決策 1. セミドライ使ってるなら→ウェットにする。 以下wet式でやるという前提の話ですが、 2. 転写バッファーに最終濃度0.02~0.05%になるようにSDSを添加する。 3. 転写時間を １．５倍くらいまでのばす。 4. サンプル調製時に加熱あり、無しの２種類を用意して比べてみる。 5. ゲル濃度８％のゲルで泳動する。 6. 濃縮ゲルも切り離さずに、転写する。 7. 他の分子量のものとは至適条件がことなることもあるかもしれないので、１枚でリプローブして全部済まそうとせず、250k用は別にやった方がいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8596-5 - 2020/01/25 (土) 23:34:11 - mon 調整じゃなくて調製だろ。 まず膜は切るなよ。大抵のビッグジャーナルはフルメンブレンのスキャンを要求してくるぞ。250じゃなく分解されたものが下の方に出てきとるかもしれんだろ。そういうことも知れるからまず膜全体を最初は染めてみろ。 転写はウエットかセミドライか？

(無題) 削除/引用 No.8596-4 - 2020/01/25 (土) 20:18:56 - はい その蛋白が採取した細胞または組織にそもそも発現していない、あるいは検出限界以下。 高分子領域の膜転写効率が悪かった。 抗体が悪い。抗体入れ忘れた、二次抗体の種を間違った。 この辺りがあなたのレベルに合わせた適当な回答かと。

(無題) 削除/引用 No.8596-3 - 2020/01/25 (土) 19:09:22 - asan 漠然と、ただ出ません、と言われても、あなたがどういう手順でどう言う方法でやって何を持って出ると信じてて出ないのかわからないので、第三者が答えようがないです。 せめて、やった手順を記載するとか、どのようなトラブルシュートまで検討したのかとか、どういうポジコンネガコンを前提に自分の手や試薬がおかしくなってないと言い切れるのか、そう言う情報を乗せたらとおもいます。 そう言うのが面倒だとおもうならば、近くの人に相談するか、自分で考えたほうが手っ取り早いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.8596-2 - 2020/01/25 (土) 16:57:06 - め 分子量が大きいので膜への転写が十分にできていないとか そもそも抗体条件がよくないとか 膜タンパク質だったら煮沸で凝集するとか

Western blot法でのタンパク質検出 削除/引用 No.8596-1 - 2020/01/25 (土) 15:41:28 - ｓ 一回のSDS-PAGEからターゲットとなるタンパク質付近のメンブレンを切り抜きタンパク質を検出しているのですが、一つのタンパク質が上手く検出されません。 それぞれ250,65,42kDのタンパク質で、250kDがうまくでません。 分子量があまりに違うからか、サンプル調整の問題なのか・・・ どなたかお願いいたします。

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