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(無題) 削除/引用 No.8594-10 - 2020/01/31 (金) 19:30:31 - AP 昔はcDNAといえばライブラリーからクローニングしてとっていたものだから、5' UTRも3' UTRも、内在性のKozak配列も、ほとんどの場合d(T)nでプライミングするからpoly Aやpoly A signalさえ含まれているのが普通でした。 だから、発現ベクターに入れるときも、ベクターの方でpoly A signalなんかを備えておく必要性があまりなかった。SV40 terminatiorが組み込まれていようと、cDNAの3' UTRにあるpoly A signalでpoly A がついていたし。 で、質問者さんのcDNAには内因性のpoly A signalもなく、ベクターにも備えられていないということなのでしょうか。 実際どういうデザインになっていて不完全なターミネータとはどういうもので、どういう問題に直面しているか、手の内を明かさず聞くだけ聞くってのも、核心に迫れずある意味損だ。

(無題) 削除/引用 No.8594-9 - 2020/01/31 (金) 19:10:27 - こころ >[Re:8] おおさんは書きました : > >PolyAサイト以外のところでアクシデンタルに転写が終結した場合、PolyAはRNAの安定性に関与するのでおそらく分解されるだろうと推測できます。 > では、アクシデンタルに転写が終結した場合は遺伝子の発現は起こりますでしょうか。 > > >ということは、polyatailがつかないような3'UTRを設計してしまった場合、効率はすごく落ちるかもしれないけれど遺伝子の発現自体は確認できるということでしょうか？ > > 翻訳が起こるかといえば起こっていると思えるデーターはいくらかあるようですが、確認ができるかどうかというのは検出レベルなども関係しますのでできるとまでは言えません。 ➡やはり自分の構築したプラスミドの転写を見てみないことには始まらなさそうですね。 貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8594-8 - 2020/01/28 (火) 01:13:17 - おお >PolyAサイト以外のところでアクシデンタルに転写が終結した場合、PolyAはRNAの安定性に関与するのでおそらく分解されるだろうと推測できます。 では、アクシデンタルに転写が終結した場合は遺伝子の発現は起こりますでしょうか。 >ということは、polyatailがつかないような3'UTRを設計してしまった場合、効率はすごく落ちるかもしれないけれど遺伝子の発現自体は確認できるということでしょうか？ 翻訳が起こるかといえば起こっていると思えるデーターはいくらかあるようですが、確認ができるかどうかというのは検出レベルなども関係しますのでできるとまでは言えません。 >また、下流に強いpolya signalが存在して少し上流にあるリードスルーを起こす可能性があるpolya signalのみをクローニングしてしまった場合、 リードスルーによって下流の遺伝子に対して転写干渉を起こしてしまいますか？ よく使われる発現ベクターでもある程度そういうことが起こっていてそれでも機能しているのは事実です。またウイルスベクターでは複数のプロモーターがあり、ことなるTranscription start sitesから発現したいCording regionをふくむRNAができています。

(無題) 削除/引用 No.8594-7 - 2020/01/26 (日) 16:36:35 - こころ > 不完全なものでも転写は起こるのですよね… [Re:4] APさんは書きました : > そのターミネータというのはどういう配列、どういう由来のものを指しているのだろう？ > > 細菌のmRNA転写系とは違って、真核生物でmRNAを転写するRNA pol IIには、確とした転写終結配列というものはないので、これがターミネータでございというようなものはないはずだけど。発現ベクターの3'側にSV40 terminatorと称するSV40の３' UTRが組み込まれているけれど、あれはpoly adenylation signalを含む3' UTRを付与するというだけでほんとうの意味でterminator 転写終結配列というわけではないと思う。 > > 真核生物mRNAの転写はpoly adenylation signalで転写がするわけじゃないですよね。もっと下流の不特定のところまでだらだらリードスルーして、poly adenylation signalの10-20 ntくらいで切断されたあとにpoly A polymeraseがpoly Aを付加するわけで。 > > なので、特別な配列が無くても転写終結は勝手に起こる。 > でもpoly adenylation signalはpoly A tail付加には必要。 > 生体内にもpoly A tailがないmRNA、あっても数塩基のものもある（poly adenylation signalの有無に関わらず）。そういうmRNAも翻訳されないことはないけれど、普通に長いpoly A tailをもつヴァージョンと比較すると翻訳効率がかなり落ちる（1/50)という報告はある。 > > >

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.8594-6 - 2020/01/25 (土) 15:42:53 - こころ >PolyAサイト以外のところでアクシデンタルに転写が終結した場合、PolyAはRNAの安定性に関与するのでおそらく分解されるだろうと推測できます。 では、アクシデンタルに転写が終結した場合は遺伝子の発現は起こりますでしょうか。 また、下流に強いpolya signalが存在して少し上流にあるリードスルーを起こす可能性があるpolya signalのみをクローニングしてしまった場合、 リードスルーによって下流の遺伝子に対して転写干渉を起こしてしまいますか？ どうかアドバイスをお願いいたします。

ありがとうございます。 削除/引用 No.8594-5 - 2020/01/25 (土) 15:36:28 - こころ ということは、polyatailがつかないような3'UTRを設計してしまった場合、効率はすごく落ちるかもしれないけれど遺伝子の発現自体は確認できるということでしょうか？ >なので、特別な配列が無くても転写終結は勝手に起こる。 でもpoly adenylation signalはpoly A tail付加には必要。 生体内にもpoly A tailがないmRNA、あっても数塩基のものもある（poly adenylation signalの有無に関わらず）。そういうmRNAも翻訳されないことはないけれど、普通に長いpoly A tailをもつヴァージョンと比較すると翻訳効率がかなり落ちる（1/50)という報告はある。 ちなみにターミネーター配列はプラスミドからクローニングした、よく説明書などでsv40ターミネーターと記載されるものでした。 なのでAPさんのおっしゃったようにpolyasignalを含んだ3'UTRを指していました。

(無題) 削除/引用 No.8594-4 - 2020/01/25 (土) 14:40:35 - AP そのターミネータというのはどういう配列、どういう由来のものを指しているのだろう？ 細菌のmRNA転写系とは違って、真核生物でmRNAを転写するRNA pol IIには、確とした転写終結配列というものはないので、これがターミネータでございというようなものはないはずだけど。発現ベクターの3'側にSV40 terminatorと称するSV40の３' UTRが組み込まれているけれど、あれはpoly adenylation signalを含む3' UTRを付与するというだけでほんとうの意味でterminator 転写終結配列というわけではないと思う。 真核生物mRNAの転写はpoly adenylation signalで転写がするわけじゃないですよね。もっと下流の不特定のところまでだらだらリードスルーして、poly adenylation signalの10-20 ntくらいで切断されたあとにpoly A polymeraseがpoly Aを付加するわけで。 なので、特別な配列が無くても転写終結は勝手に起こる。 でもpoly adenylation signalはpoly A tail付加には必要。 生体内にもpoly A tailがないmRNA、あっても数塩基のものもある（poly adenylation signalの有無に関わらず）。そういうmRNAも翻訳されないことはないけれど、普通に長いpoly A tailをもつヴァージョンと比較すると翻訳効率がかなり落ちる（1/50)という報告はある。

(無題) 削除/引用 No.8594-3 - 2020/01/25 (土) 01:31:34 - おお 単純な質問のように見えますが答えるには奥が深そうです。 バクテリアのばあいはターミネーターがなく下流の遺伝子にまでTranscriptionが伸びていきポリシストロニックなmRNAができることはよく知られていると思います。また、ターミネーターが何らかの制御を受けていてポリシストロニックなmRNAができるか、そうでないか決まるような例があったんじゃないかなと漠然におもっています（間違えだったらごめんなさい）。 真核生物の場合弱いポリAサイトがあるようですが、そこを通り越して下流のポリAサイトで止まるということも起こっているようです。それによってUTRの配列が代わり、その配列がmRNAの安定性、局在、翻訳効率などを積極的に制御している場合もあります。スプライシングパターンがかわり違う isoformsができることもあります。 弱いポリAサイトで転写が集結したばあい、たとえば同じ位置につよいPolyAサイトを入れ替えたときにできる転写産物のBehaviorが一緒かどうかと言われると、その手の研究は実際の生理的現象としては見かけたことがありません。どんな遺伝子のコーディングリージョンを人工的な発現ベクターに組み込んだ場合、同じPolyAサイトが機能することにはなりますが。 PolyAサイト以外のところでアクシデンタルに転写が終結した場合、PolyAはRNAの安定性に関与するのでおそらく分解されるだろうと推測できます。 ということを把握した上で、Read throughという現象は起こっていて否定できる余地はありません。バクテリアにおいても起こっていると思われますが私はそれに関して詳しくはありません。真核生物においてはいまのところ生理的な機能においては不明ですが、実際に観察されることから問題提起は最近になっても見受けられます。 http://www.ensembl.info/2019/02/11/annotating-readthrough-transcription-in-ensembl/

(無題) 削除/引用 No.8594-2 - 2020/01/24 (金) 20:27:10 - こころ 追加の質問 ターミネーターのない遺伝子は発現しますか。 先輩方、どうかお教えください。

不完全なターミネーター配列の影響に関して質問 削除/引用 No.8594-1 - 2020/01/24 (金) 20:19:01 - こころ いつも参考にさせていただいてます。 早速ですが、ターミネーター配列やポリAシグナルが不完全な場合、その遺伝子の転写は終結しますか、しませんか。 また、転写終結が起こるのならばその遺伝子の発現量に影響を及ぼすでしょうか。 不完全なターミネーター配列の下流には転写に関わる配列はありません。 どうか回答をお願いいたします。

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