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(無題) 削除/引用 No.8591-14 - 2020/01/25 (土) 03:55:31 - ラスカル 洗浄回数に関してですが、私は一次抗体は10分3回、二次抗体は15分3回で統一しています。これ以上洗浄回数を増やすメリットがあるかどうかについては、経験から私は懐疑的ですが、それこそ経験から回数が重要と思われている方がいることも理解できます。2分2回に5分一回がベストだ、と主張していた友人もいますし、30分（！）4回が絶対という人もいました。 そういえば、まだ何もわかっていない学部生の時に（今考えるとかなりアホな話なんですが）洗浄液を用事調整するように指導されていて、毎回50mLを作ってメンブレンを洗っていたんですが、回数を3回に分けた場合と6回にわけた場合では6回の方が汚い結果になることが多く、一回の洗いに使う洗浄液の量がある程度無いと洗いの効果が期待できないのかなと思っていました。まあ、これも人によって流儀が（かなり）違うだろうなと思います。 ともあれ、どのやり方でもきれいなバンドが出ればそれで良いと思います。自分も結構難しい（シグナルの弱い）ウェスタンもやってきたというつもりでいますが、上記の知人たちも同じような経験を積んでいますし。 AAさんがおっしゃるように蓋がつくタッパーで行うのも悪くないと思うのですが、不精なため蓋の開け閉めを面倒臭がってしまいます。奈緒推しさんが言うように、思い切ってシェーカーを買ってしまうのも手だなと思えてきました。自分で買わずともボスに言えば買ってくれそうな気もしてきました。 独り言さんのお話はよくわかります。話がわかる相手であれば、同じサンプルを流したメンブレンを短冊状に切って、それぞれ別条件で洗って結果を見せる、という手があったとは思います。まあ、その点については解決したので、ありがたいことに今はその必要がなくなりました。

(無題) 削除/引用 No.8591-13 - 2020/01/25 (土) 03:53:29 - ラスカル 洗いに関してですが、自分のこだわり（Voodooとも言えるか）としては １）液量重視 ２）回転速度はあまり重要ではない（但し、といって回転ゼロで良いかといえばそんなことは無く。一度シェーカーが故障したときに、洗浄液にただつけて2分おきに手で揺すってを5回繰り返してから洗浄液交換、これを4サイクル繰り返してでやったことがありますが、かなり汚い結果になったことがあります） ３）メンブレンより少し大きいコンテナで洗って、メンブレンが動くようにしている（JJIさんと一緒）。なのでコンテナは出来る限り平らなものを使ってる。一度チップボックスの蓋で真ん中に丸い盛り上がりがあるのを使って洗ったら、思ったようにキレイにならなかった経験あり。 ４）洗浄液交換の際には、出来る限り前の洗浄液を除くようにしている。具体的には、メンブレンをピンセットで持ってコンテナから離した状態で前の洗浄液を捨てている。メンブレンがコンテナの底面に張り付いたままでの交換だと、結構な量の洗浄液が残ることに気づいたから。（自分の中では、T-2さんのお話にある洗浄液でのリンスを挟むステップの簡易化バージョンのようなもの。違うか） このあたりは皆さんが書かれているのと同じだと思います。

(無題) 削除/引用 No.8591-12 - 2020/01/25 (土) 03:51:56 - ラスカル 皆様、私の興味本位の質問に答えて下さってありがとうございます。しょうもない話だからリプライほとんどつかないかなと思っていたんですが、思いのほか多くの方が答えて下さいました。 液量重視の方がほとんど、というか回転速度重視の方は一人もいませんでしたね。 いなくなった同僚はInvitrogenのミニサイズのゲルで作ったメンブレンを、9x7cm位の容器に入れてメンブレンがぎりぎりつかる程度（4、5mL程度か）入れて激しく振盪して洗ってました。もちろんキレイになる訳も無い（分かりやすい時には、真ん中に楕円形の汚れが残っていたり）のですが、こっちの方がキレイになるよと言っても頑なにそのやり方にこだわっていました。難しい（発現量の物凄く低い）タンパクを見ようとしていて、簡単なブツを扱っている君等には理解できんのだまで言っていましたから、まあ処置無しでした。そういう性格が災いしたこともあってラボから居なくなったので、まあ彼に関しては既に解決済みなのです。ただ、彼とのやりとりから、こうやれば少ない液量で早い回転速度でもキレイに洗える、みたいな話がもしもあったら洗浄液の節約になるかもなあとも思っていましたが、やっぱりそんな方法は無いみたいですね。

(無題) 削除/引用 No.8591-11 - 2020/01/24 (金) 17:22:19 - T-2 回転式の機械だと遠心力で液が外側に集まり、 真ん中においたメンブレンが洗浄されてないかも。 洗浄液はたっぷりめで使ってますが、 某検出器メーカーさんのアドバイスでは各洗浄ステップの時、 洗浄液を捨てて、新しい洗浄液で軽くすすいで捨ててから 新たに洗浄液を加えてシェイキングするとよく洗えると おっしゃっていました。

(無題) 削除/引用 No.8591-10 - 2020/01/24 (金) 16:33:13 - JJI Membraneが十分動くことができるように、memmbraneよりもひと回り以上大きいある程度のサイズのタッパーを使うようにしています。液量とbufferの交換回数はある程度多いほうがいいです。振盪速度はあまり関係ないです。

(無題) 削除/引用 No.8591-9 - 2020/01/24 (金) 12:24:36 - AA 液量の方を優先しています。 ただ、私の身の回りにも速度を気にする人がいますので、 私は自分でタッパーのような密閉容器をいくつかのサイズで用意してそれで洗っています。 密閉容器ならこぼれませんし積み上げることもできるのでスペースの奪い合いにも強いです。

(無題) 削除/引用 No.8591-8 - 2020/01/24 (金) 10:57:50 - asan 一般的にシェイクは蒸発して表面が乾かないように、液量をケチるためにやることが多いです。もちろんムラができたりすることを避ける意味もあるだろうし、物理的に動いた方が拡散されて綺麗になると思いますけどね。 ただ、washに限っては過剰量の液があった方が綺麗になると思います。受動拡散なので結局透析と同じ。というか特に最初の方は頻繁に液を変えた方がいい。 例えば免染色で水滴を作ってそこに泡が入らないように細胞をつけたプレートを置いたりすることもあるでしょ。

(無題) 削除/引用 No.8591-7 - 2020/01/24 (金) 10:16:03 - 独り言 私も洗浄液はたっぷり派です。 回転数は、特にこだわりはもってないのでわかりません。 主張が違うのであれば、同じサンプルでそれぞれの手法で行って、どちらがきれいにいくか見せ合うとか、論より証拠を提示することも、頑固な同僚を説得するときに必要かも。私たち実験系研究者ですから。

(無題) 削除/引用 No.8591-6 - 2020/01/24 (金) 10:13:04 - 774 おおさんと同意見です。 抽出(分配平衡)だと洗浄液の総量が同じなら、量を小分けにして回数を増やした方が抽出率(洗浄率)は良くなります。 抗体でもまあ同じでは。 回転数は液内の濃度差が解消されれば良い訳で、むやみに上げればいいものではない(そこまで意味がない)と思います。 液があまり大きく揺られるとメンブレンが壁にひっかかって一部乾いてしまうとかそういう事故も起きますし。

(無題) 削除/引用 No.8591-5 - 2020/01/24 (金) 10:12:12 - み 希釈していくことが大事と思っている。 回転数はあまりにもゆっくりなのは避ける。っというか普通に振とうできる状況ならやるでしょうという感じでゆっくり振る理由がない。 個人的には回数と液量の両方が重要なファクターで、３回しか洗わない時は多めの量でやって、５回洗う時はそれより少なめの量。 タグ抗体とかSN比が良いものは前者、内在性やSN比が悪い抗体には後者でやったりする。 まあ３回しか洗わない場合でも時間長めにやるとか微調整するけどね。

(無題) 削除/引用 No.8591-4 - 2020/01/24 (金) 09:54:43 - aaa シーソー型のシェーカーでは容器を斜めに置くと全体が撹拌されていいと思います。洗浄液たっぷり派です。

(無題) 削除/引用 No.8591-3 - 2020/01/24 (金) 08:35:47 - おお 同僚もなんだか社会性がないというか、 そんなことは置いといてちょっと面倒でも液量減らして１、２回洗いでのバッファーの交換を増やしたらどうですか？ わたしはどちらかというと洗った溶液の量に依存すると思ってます。実際はどうかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.8591-2 - 2020/01/24 (金) 08:31:30 - 奈緒推し 私は一台っていうのがめんどくさい原因だと思ったので、自分で一台買いましたね。 それでラボに寄付しました。アメリカなので200ドルくらいで十分なの買えました。 ボスが返金してあげると言われはしましたが、まぁいいやってな感じで。

ウェスタンブロットの洗い 削除/引用 No.8591-1 - 2020/01/24 (金) 07:16:04 - ラスカル ウェスタンブロットの洗い 洗浄液の容量か？シェーカーの回転数か？ よろしくお願いします。 しょうもない話なのですが、ウェスタンブロットのメンブレンの洗いについて、バックをキレイに落とすのに、皆さんは １）洗浄液の容量 ２）シェーカーの回転数 どちらが大事に思われますか？ 私は洗浄液（TBS-T使ってます）はケチらずにある程度の量を使わないとキレイにバックが落ちない、というか充分量の洗浄液があれば回転数はあまり関係ない、とすら思っています。実際ロッキングタイプの振盪機（という名称でいいのだろうか？）でゆっくりと振盪させた場合でも、洗浄液が充分にあればキレイにバックが落ちるのを経験してきたからです。逆に、洗浄液を作るのを面倒臭がって少ない量で洗うと大概汚い結果になっていたし、洗浄液の少ないのを補填しようと回転式のシェカーの回転数をかなり上げて激しく洗っても、やはり汚い結果に終わったことがほとんどだったからです。 さて、イマのラボには一つしかシェーカー（回転運動をするタイプ）が無いため、ラボメンバー全員がウェスタンの洗いの時にはこれを使っています。で、「洗浄液の量が少なくても回転をあげればキレイにバックが落ちる筈」と主張する同僚が、あとから割り込んできた場合でもシェーカーの回転数を上げて、先に入れていた私のコンテナから洗浄液がこぼれまくって私が掃除しなくてはならない羽目に陥ったりしています。文句を言ったのですが、回転数が一番大事であり洗浄液の量を減らさないオマエが悪いと言われる始末です。 この同僚との諍いについては急に解決することになった（同僚が別のラボに移ることになった）ので良いのですが、今更ながら上記の問題、洗浄液の量か？回転数か？の問題がなんとなく気になって皆さんにお聞きする次第です。自分は洗浄液の量が最も重要なファクターだと思っていますが、先に書いた通り経験的になんとなくそう思っているだけです。もしかしたら比較検討の結果、洗浄液の量はあまり大事ではない、重要なのは回転数だ、と思っておられる方もいるかも知れないと思ってお聞きする次第です。 興味本位の質問ですが、もし良かったら皆さんのご意見お聞かせ下さい。

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