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(無題) 削除/引用 No.8569-13 - 2020/05/25 (月) 10:34:07 - こころ ＞plantさん お返事が遅くなり申し訳ありません。 教えていただきありがとうございます。 こちらも同様の状況でした。最近は実験が少しですができるようになってきました。 他のホモロジで発現・精製できたとのこと良かったです。 こちらは原因を考えてもよくわからないので、他の方法を検討するしかなさそうです。 教えていただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8569-12 - 2020/05/03 (日) 08:33:52 - Plant ＞こころさん 正直に言いまして，あまりうまくいっていません． あの後，別のホモログでうまく発言・精製（これはGFP fusionではないです）できるようになり，少し放置していました． そろそろ始めようかと思っていた矢先に，コロナ関係により，ラボがシャットダウンされており，4月から実験ができていない状態です． 現在，His-tagのみのコンストラクトも作成しておりますが，全長の，トランケーションしていないものを同じようにコンストラクションして，膜タンパク質として精製できるのかも検討しようと思っています． 参考にならなくて申し訳ありません．

(無題) 削除/引用 No.8569-11 - 2020/04/27 (月) 10:42:06 - こころ ＞plantさん こんにちは。 histagのみで精製して分離できましたでしょうか。 実は、histagを使用して、plantさんと同様にhistag切断後に目的蛋白質が離れなくて困っています。 切断がうまくいっていることは、SDS_PAGEで確認済みです。 その後の実験の進捗状況を教えていただけますと助かります。

(無題) 削除/引用 No.8569-10 - 2020/01/22 (水) 10:59:49 - plant おおさん 私も同じようなことを疑っています。 すなわち、Tag(GFP)がついていることで辛うじて可溶性に来ている、つまり、GFP以外の目的タンパク質のポリペプチドはフォールディングしていない可能性があると思っています。 しかし、GFP自体も疎水性がそれなりに高いことを考えると、おっしゃるとおっリ、TagをHis-tagだけにして同じように精製してみるなどしたほうがいいかもしれません。 detergentは、検討したいと思います。このような場合、DDM/DMなどミセルサイズが大きいもののほうがいいのでしょうか。こればっかりは、やってみないと分からないというものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8569-9 - 2020/01/22 (水) 10:52:44 - plant 皆さんありがとうございます。 Nanasiさん ＞それ自体が金属イオンに結合する機能は無いのですか？ HisやCysが多い領域が有るとか これまでの知見ではそのような領域および、機能は無いとされています。 しかし、まだまだ研究が進んでいないタンパク質なので、後々金属イオンとの相互作用が見つかるかもしれません。 れwqさん ＞このリコンビナントタンパク質を何に使うのですか。その研究目的からみて疎水性領域を削ってしまっても構わないのですか。というのはHis-tev-GFP-タンパク質を得ることそれ自体のためにけずってるとしたら、どうなのかなあと思うので。 全長のタンパク質が発現量・可溶化効率に問題があることから、膜外領域のみを結晶構造解析することを目的に今回の実験を行っています。 しかし、このタンパク質が、本来の構造をどの程度保っているかなどは、不明です。（精製後、活性測定を行うつもりでした）

(無題) 削除/引用 No.8569-8 - 2020/01/21 (火) 00:55:37 - おお サイトゾルに局在するような蛋白でもバクテリアなどで発現すると不溶性として発現してしまうケースは多々あります。GSTやおそらくGFPはそういう蛋白の可溶性を高めるので、そのようなタグをつけて発現して（可溶性が維持できるので）そのまま使うこともよくあります。またGSTなどをプロテアーゼで切断すると可溶性を維持できずにアグってしまう（カラムにひっかかって溶出できないとか、沈殿してしまう）ことはよくあります。 なのでデタージェントは使えないのかと提案した次第です。ただしものによってはデタージェントでも解決しにくい場合があります。 と書きながらお示しの例ではどうなっているかについて何ら答えになってなかったようにおもえたのですが、切断後の目的のポリペプチドがGFPを巻き込んでアグっているためGFPと同じような挙動をしめすのかもしれませんし、目的のポリペプチド自身がNiカラムにある程度親和性がある場合も考えられるでしょう。 後者の場合ヒスチジンの濃度、pHなどを工夫して分離できる条件を探すか、Niカラム以外の分離方法を使うか。前者の場合His-tev-タンパク質で発現するとどうか。 もちろんこういう実験は理屈道理になるとも言い難いのですが今後の方針の一助になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8569-7 - 2020/01/20 (月) 23:28:35 - れwq このリコンビナントタンパク質を何に使うのですか。その研究目的からみて疎水性領域を削ってしまっても構わないのですか。というのはHis-tev-GFP-タンパク質を得ることそれ自体のためにけずってるとしたら、どうなのかなあと思うので。

(無題) 削除/引用 No.8569-6 - 2020/01/20 (月) 22:43:14 - Nanasi それ自体が金属イオンに結合する機能は無いのですか？ HisやCysが多い領域が有るとか

申し訳ありません･･･ 削除/引用 No.8569-5 - 2020/01/20 (月) 22:26:01 - plant 情報が不足していて申し訳ありません。 His-tagーGFP-目的タンパク質の順にコンストラクトは作製しております。 TEVプロテアーゼサイトはGFPと目的タンパク質の間にあります。 目的タンパク質については、N末端に膜相互作用部位が推定されるため、それをトランケーションしています。 全長で発現させると膜画分に発現するため、detergentが必要ですが、このトランケーションに関しては、破砕後、可溶性画分に来ます。 それをNiカラムで精製するところまでは、問題なく進めることができます。 しかし、tagを切断後、再度Niカラムに通し、His-tagーGFPを取り除こうとすると、目的タンパク質までNiカラムに吸着しています。

(無題) 削除/引用 No.8569-4 - 2020/01/20 (月) 07:15:20 - あの ＞今回、sf9細胞で一過性発現させたGFP fusionの目的タンパク質をNiカラムで精製後、TEVプロテアーゼでO/N,4℃処理しました。 小学生じゃないんだから、GFP融合タンパク質をNiで精製ってちぐはぐなことを言うからトピック全体に胡散臭さが漂うんですよ。 GFPタグはどこに付けたのか、ヒスタグはどこなのか、予想される結果はなにで、実際に起きた結果は何かをもう一度書きなさい。

(無題) 削除/引用 No.8569-3 - 2020/01/19 (日) 04:14:23 - vxfcrtfyぐ これTAP tag？(TEV sensituve siteはどこに入れてるの？）それともN末C末にそれぞれタグつけてるの？どういう風にタグつないでるのか教えてください。 多分、切れたGFP部分と精製タンパク質本体が疎水的な相互作用でくっついてる気がするんだけど。強めのdetergent使うのも手だけど、経験ではあまり改善しない予感がするので、根本的な解決にはtagの種類を変えるかするのが良いと思う。

(無題) 削除/引用 No.8569-2 - 2020/01/18 (土) 10:05:11 - おお 膜貫通部位を削っているから疎水性が高いってるように思えるのだけど、、、そうだったら削れば疎水性は低くなる？ デタージェントは使ってないのですか？

GFP tagがTEV切断後も目的タンパク質から離れない 削除/引用 No.8569-1 - 2020/01/18 (土) 08:23:03 - plant いつも勉強させていただいております。 今回、sf9細胞で一過性発現させたGFP fusionの目的タンパク質をNiカラムで精製後、TEVプロテアーゼでO/N,4℃処理しました。(透析を同時に行うことでイミダゾールを抜いています) 翌日再度Niカラムを通し、素通りを回収しようとしたところ、ほぼすべての目的タンパク質がGFPが切れているにもかかわらず、Niカラムに吸着し、GFPと一緒に溶出されてしまいました。 (GFPが切れていることはSDS-PAGEで確認しています) 目的タンパク質はもともと膜タンパク質で予想膜貫通および相互作用部位をトランケーションしたもののため、疎水性がかなり高い可能性はあると思われます。 何か解決方法は考えられますでしょうか？ご経験等も聞かせていただけると幸いです。

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