こんにちは、薬学部の5回生です。
ただいまマウスの肝臓からRNA抽出をして逆転写反応そしてPCRをかけたところGapdhのCt値が約18.5くらいでした。先輩からの指示でDNaseとエタノール沈殿をかけて同じく逆転写反応、PCRをかけた時にCt値の再現性がとれるか検討する実験を行いました。
実験手順は以下の通りです。
DNase処理(1回目)
・RNAの必要量を6μgとした(測定したRNA濃度=3.183 μg/μL)
RNA in water(μL) 1.83
Buffer(μL) 1.0
DNase(μL) 6.0
DEPC処理水(μL) 1.14
全量 10μL
37℃, 30min, インキュベート
stop solution 1μL 加える
65℃, 10min, インキュベート
エタノール沈殿
Sampleの液量を100μLにfull up(1.5mLチューブ)
99.5% EtOH 250μ;L
3M酢酸Na 10μL
タッピング
-80℃,30min, 放置
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる(普通に流す)
75% EtOH 250µL
洗浄
遠心分離(18,000×g, 4℃, 15min)
上清を捨てる
風乾(10min)
10µLのDEPC処理水に溶解
吸光度測定
RNA濃度=0.197μg/μL
それからいつも通り逆転写反応とPCRをかけました。
Ct値は約25と大幅に高くなった。
考察した問題点と解決策
・回収率が約30%しかないしトータルRNA量としても少ないのでRNA必要量を6μgから12μgに増やした。RNAの濃度が低い時に希釈時にトータルRNA量を調整してはいるが前回も高いCt値を示したことがあったので。
・-80℃放置の時間が足りなかったので30minから1hまで放置した。
・遠心分離の時間も15minから30minに増やした。
・逆転写酵素が古い可能性があったため新しいものを使用した。
以上のことをすべて行った結果Ct値が約20.4まで下げることには成功したが最初に測定したCt値約18.5との比べると再現性がとれていたとは言い難い結果になってしまった。
長くなってしまいましたが、他にどのようなことを行えばCt値がもっと下げることができると思いますか？
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