今までに大腸菌をLBで培養した上清中に、別の菌に対する抗菌活性があることを見つけました。
そこで、含まれる分子を分離同定するために、ゲルろ過クロマトグラフィー → HPLC → MS解析 を行うつもりです。
HPLCで用いるカラムを選択するために、最低限、親水性か疎水性か知りたかったので、
分液ロートを用いた操作を少し改変して実験を行いました。
(機器がなかったため、簡易的に改変した。)
・50 mlチューブに、大腸菌の培養上清とクロロホルムを20 mlずつ加え、激しく振る。
・静置し、分離するのを待つ。
・電動ピペッターを用いて、水層、中間層、クロロホルム層に分け、新しい50 mlチューブに移す。
・各50 mlチューブの蓋を開けた状態で、80℃の温浴で加温し溶媒を蒸発させる。overnight
・チューブの底に固形物が残っているのを確認し、固形物を10 mlのLB brothで再溶解する。
・どの分画が殺菌活性を有するかassayする。
という流れでやろうと思ったのですが、それぞれの層を蒸発させたのちに残った固形物をLBで再懸濁しようとした際に、
水層からでてきた固形物はすぐに溶けたのですが、中間層とクロロホルム層の固形物が全く溶けませんでした。
時間が経てば溶ける、とかのレベルではないです。
よくにクロロホルム層からの固形物は、粉末状ではなく、一体化して膜のようになっており、しょうがないのでホモジェネーターを用いてバラバラに砕きましたが、一向に溶ける気配がありませんでした。
親油性のものを抽出したとはいえ、もともとLBに溶けていたものが再溶解できないのはなにかおかしいと思います。
一つ考えられるのは、蒸発の際に加温したことです。
過去の論文は凍結乾燥を用いていました。
また、有機系などでは、エバポレーターを用いて低温で蒸発させると聞きます。
クロロホルムは加熱すると分解してしまうというネットの情報もありました。
ただ、現状機器がないので、すぐに条件検討ができません。
もし、上記の方法を見て問題点がお分かりになる方が至っしゃったらご教示いただけると幸いです。
その上でどうしても必要であれば機器を購入できるかPIの先生に頼みたいです。
よろしくお願いします。 |
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