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タンパク質複合体解析について トピック削除
No.8555-TOPIC - 2020/01/14 (火) 06:11:43 - タンパク質複合体
ある二つのタンパク質が細胞膜上で結合するのではないか、というデータが出ました。
ジギトニンで可溶化した細胞ライセートからの免疫沈降でも結合を確認出来ています。

そこでその二つを含むタンパク質複合体の全貌を掴むため、質量分析計を用いたタンパク質の同定を行いたいです。

同じような目的の論文を調べたところ、細胞をジギトニンで可溶化させ、ライセートからBN-PAGEを用いてタンパク質複合体を分離し、平行してウエスタンブロットを行い、ゲルのどの位置に目的のタンパク質を含む複合体があるかを示した上で、その高さのバンドを切り出し、質量分析にかけるというものです。

BN-PAGEの他には、クロスリンカーでタンパク質複合体を架橋させ、その後、免疫沈降で目的のタンパク質を精製するというものです。

前者では切り出したバンドの高さの中にはその複合体とは無関係なタンパク質もものすごく含まれていると想像できますが、クロスリンカーの方では免疫沈降で複合体を精製するため、ある程度、質量分析計のバックグラウンドは抑えられるのではないかと想像しています。

架橋した後でも免疫沈降がきちんとワークする抗体があるのなら、クロスリンカーを用いる方法がマッチベターでしょうか？
周りにこの分野に明るい方がいらっしゃらないので、ここでお聞きしました。
よろしくお願いします。
　
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No.8555-4 - 2020/01/20 (月) 22:19:49 - ertyui

クロスリンカー使うと緩い結合のものも捕まえられる可能性もありますが、経験ではクロスリンカー使うとIPがどうもうまくいかなくあることが何度かあった（普通のIPはできる抗体でした。）のでちょっと気になります。普通にライゼートからIPできるならそれでやった方が良い場合もあります。予算的にSILACとかの定量プロテオミクスが可能なら、免疫沈降精製物の純度はあまり気にしなくてもいいと思います。（dish 1 12C-Arg標識培地で培養→抗体でIP, dish2→13C- Arg-標識培地で培養→nourmal IgGでIP)

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No.8555-3 - 2020/01/14 (火) 10:18:13 - asan

脱クロスリンクすればある程度は可能だとおもいますけど、自分がやるならまずは素直にそれぞれのIPあるいは、2nd IPで銀染色でもやってみてどのくらいの結合が通常で検出できそうかやってからにします。

類似の方法でやってる論文があればその通りやるのはありですが、大規模解析は基本まずはシンプルなところから、入った方が経験上はよいです。

あと、複合体の全体像を議論したいのか、複合体に含まれる個別分子の機能解析まで落とすつもりなのかによってもどっちがいいかはあると思いますね。前者の場合は多少のノイズがあっても全体できちんと何かしらの変化が追えればいいが、後者の場合はノイズを拾いすぎると何を見てるのかわからなくなることが多いです。

(無題) 削除/引用
No.8555-2 - 2020/01/14 (火) 08:48:53 - おお
BN-PAGEで分離できるならクロスリンクせずにIPでもなんとかなると思います。クロスリンクはMSで高感度だとノンスペ（全く関係ないものがたまたまクロスリンクされる）がきになります

コンプレックスの全容というならばまずはBN-PAGEをして大きさなど見てみるといいかと思います。それで安定したコンプレックスがみれるなら。ゲルからNativeの状態で溶出してIPするっていうのもいいかもしれませんし、BN PAGEのまえに一段回精製をかます（DEAEなどイオン交換カラムとかゲルろ過とか、カラム以外にも方法があるかもしれません）とBNPAGEから切り出し、MS解析でもバックグランドが減らせるでしょう。

タンパク質複合体解析について 削除/引用
No.8555-1 - 2020/01/14 (火) 06:11:43 - タンパク質複合体
ある二つのタンパク質が細胞膜上で結合するのではないか、というデータが出ました。
ジギトニンで可溶化した細胞ライセートからの免疫沈降でも結合を確認出来ています。

そこでその二つを含むタンパク質複合体の全貌を掴むため、質量分析計を用いたタンパク質の同定を行いたいです。

同じような目的の論文を調べたところ、細胞をジギトニンで可溶化させ、ライセートからBN-PAGEを用いてタンパク質複合体を分離し、平行してウエスタンブロットを行い、ゲルのどの位置に目的のタンパク質を含む複合体があるかを示した上で、その高さのバンドを切り出し、質量分析にかけるというものです。

BN-PAGEの他には、クロスリンカーでタンパク質複合体を架橋させ、その後、免疫沈降で目的のタンパク質を精製するというものです。

前者では切り出したバンドの高さの中にはその複合体とは無関係なタンパク質もものすごく含まれていると想像できますが、クロスリンカーの方では免疫沈降で複合体を精製するため、ある程度、質量分析計のバックグラウンドは抑えられるのではないかと想像しています。

架橋した後でも免疫沈降がきちんとワークする抗体があるのなら、クロスリンカーを用いる方法がマッチベターでしょうか？
周りにこの分野に明るい方がいらっしゃらないので、ここでお聞きしました。
よろしくお願いします。
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