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(無題) 削除/引用 No.8545-17 - 2020/01/15 (水) 01:50:48 - FlowJp 横から失礼します様、 何度もありがとうございます＞＜。 コンペンセーションはデータの見せ方の一つという点に関しては理解しています。 ただ、原理までは理解していませんので、一度勉強してみます。 はい、フロージョでコンペンセーションのデータを入れずに、実験群のデータを解析しようとしてもやはり切れてしまいました。 取得細胞数が多すぎなのでしょうか...総細胞数でいうと10ミリオンは取得しているかと思います。 そこから死細胞を除き、デブリや細胞の断片などを除き、目的の細胞にゲートをかけると、漸く1000-2000個を取得出来ます。 ごくたまにデータの取得総細胞数が多すぎて、”全て表示できません”というアラートが出る時がありますが、この時のデータが見切れてしまうかどうかは今調査中です。

(無題) 削除/引用 No.8545-16 - 2020/01/14 (火) 12:46:17 - 横から失礼します うーん、コンペンセーションの原理についてはここで書いても仕方がないので、ご自身で勉強されることを強くお勧めします。 結論から言うと、コンペンセーションの変更は単なるデータの見せ方の変更です。 今回のFlowJpさんの問題はコンペンセーションのかけ方で解決できないのではないかと推察します。 コンペンセーションを一度全てはずしてみるとどうなりますか？ コンペンセーション無しでも同様に「ピークが潰れた」状態になるなら、TK-1さんの指摘通り元から検出の最大値を超えていたということになります。

(無題) 削除/引用 No.8545-15 - 2020/01/14 (火) 12:25:44 - Flowjp ちき様、コメントをありがとうございます。 大変心強いです＞＜。 > ところで、2^18=262144だけど、1002144ってどこからくる数字だろう。 はい、私の解析組織は骨髄で、解析対象はサイズ別（FSC/SSC）で2集団あります。 まず左下の非常に小さなサイズの集団と、右上の非常に大きなサイズの集団です。 一つのFSC/SSCプロット上にその２つの集団を表示させたいために、FSC/SSCともに初期設定である262,144では不十分で、この値を大きくすること（1002144）で2集団を一つのFSC/SSCプロット上に表示させています。 今日も早速データの取得を行いましたが、今日はうまく行きました。 このactual value may exceed 262,144を超えるかもしれない、というのはやはりピークが潰れてしまうが、実際にはその上の値を示す場合があるということではないでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.8545-14 - 2020/01/14 (火) 12:19:54 - Flowjp 横から失礼します様、コメントをくださりありがとうございます＞＜。 ’’コンペンセーションのかけ方によって切れる位置（データの上限の数値）が変わるため、表示できるときとできないときがあるという可能性は無いですか？’’ そもそもコンペンセーションの掛け方でデータの上限が変わってしまうことは知りませんでした・・・。 コンペンセーションの掛け方で私のような問題を回避するためにはどうしたらいいのでしょうか？ compensationは脾臓細胞をCD45で染めていますが・・・もしよろしければ、その点をもう少し教えてくださいませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8545-13 - 2020/01/14 (火) 11:20:55 - ちき 関係あるかわかりませんが、FCS3.1の仕様書には、compensationその他の理由でrangeで指定した値(この場合は262144)を越える数値がデータとして入る場合があるとありますね。 For $DATATYPE/F/ and $DATATYPE/D/ this keyword specifies the maximum range, n1, of parameter n used to acquire the data. $DATATYPE/F/ with $PnR/262144/ is commonly used by some instruments. The actual value stored in the data set may exceed this range on both sides of the interval. Specifically, there may be negative values as well as values greater than n1, e.g., as a consequence of compensation. No bit mask shall be applied when reading $DATATYPE/F/ or $DATATYPE/D/ data. ところで、2^18=262144だけど、1002144ってどこからくる数字だろう。

(無題) 削除/引用 No.8545-12 - 2020/01/14 (火) 10:56:26 - 横から失礼します コンペンセーションのかけ方によって切れる位置（データの上限の数値）が変わるため、表示できるときとできないときがあるという可能性は無いですか？

(無題) 削除/引用 No.8545-11 - 2020/01/14 (火) 07:48:26 - FlowJp TK-1様、何度もコメントをくださり、ありがとうございます＞＜。 はい、データとして存在しないものは見えないことには100％同意しています。 ただ、表示できる時があるんですよ...ってことはデータとして存在している時があるんです。 ボルテージが高すぎてデータとして存在していないものは見えないことは100％同意していますが、そうではなさそうなんです。ですからボルテージが高すぎというわけではないです。

(無題) 削除/引用 No.8545-10 - 2020/01/14 (火) 06:12:35 - TK-1 手持ちのデータで見てみましたが、切れます。データとして存在しないものを可視化しようとしても存在しないものはみえないんじゃないですか。 ですので、取り込み時のvoltageが高すぎるんですよ。

(無題) 削除/引用 No.8545-9 - 2020/01/13 (月) 05:04:34 - FlowJp ごめんなさい、書き込みをいただくためにあげさせてもらいます(><) もう一度質問内容を復唱させてください。あと、これまでに試行錯誤したことも踏まえてアップデートさせてください！ 私はある骨髄細胞において表面タンパク質の発現解析をしています。 その細胞は全骨髄細胞のうち、0.1％ほどしかいません。そのためデータ取得する全細胞数はかなりの数になり、一つのデータ（1つのチューブ）の容量は100-300MBほどになります。 0.1％ほどの細胞のサイズは非常に大きく、白血球の集団をFSC/SSCの左下に来るようボルテージを設定すると、右上にその集団は現れます。 LSRIIでデータ取得を行い、その後FlowJoで解析を行っています。 その時に”うまく解析できる時”と”できない時”があります... FSCとSSCの最大値がともに262,144であることは知っていますが、骨髄白血球とその0.1％の細胞間で表面タンパク質を比較解析したいため、FlowJoで解析時にT（Transform）ボタンを押して、FSCやSSCの最大値を262,144から1,002,144に引き上げて、骨髄リンパ球だけでなく、0.1％の巨大な細胞も同じFSC/SSCドットプロット内に表示されるようにしています。 その操作により、解析対象の2つの集団がFSC/SSCプロット上に綺麗に現れる時が”データ解析成功”で、一方、巨大な細胞の集団がFSC、SSCともに262,144以上表示されず、ピークが圧縮されてしまっている時が”データ解析失敗”です... なぜ同じ操作をしているにも関わらず、inconsistentな結果となるのかがわかりません。 過去のデータ解析と照らし合わせて、データサイズの問題ではないように思います。 またFlowJoの環境設定（preference）からcytometersに飛び、最大値の表示を262,144から1,002,144に変更させても実際のFSC/SSCプロットではFSC、SSCともに262,144以上表示されません。 うまく行く時はFSC、SSCともに1,002,144あたりに集団が認められ、その集団において発現解析ができます。 何が原因でしょうか...TK-1様の”100 kgスケールの体重計で、200kgと300kgのものの比較をできないのと一緒です。”はごもっともで、私も同意していますが、それでもFSC/SSCプロットで1002,144を表示させることができる以上は何か成功する時と失敗する時とで違いがあるのだと思います...＞＜。 長くなり大変申し訳ありませんが、とても困っています。 どなたかご教示いただけるようでしたら、どうか、コメントをくださいますよう伏してお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.8545-8 - 2020/01/09 (木) 08:38:11 - FlowJp すみません、追記です。 ボルテージに関してはコンペンセーションで脾臓を用い、CD4とCD8などを染めてボルテージ設定しています。今回私の興味対象の細胞はGFPがめちゃくちゃ高い細胞（mTmG）ですので、GFPのユニットが10＾7までFlowJoで見ようとしていたのですが...このようになってしまっています。

(無題) 削除/引用 No.8545-7 - 2020/01/09 (木) 08:35:12 - FlowJp TK-1様、ありがとうございます...。 スケールの例え、わかりやすいです。 アップロードしてみましたが、以下のアドレスからドットプロットを見ることができます。 白猫アップローダにアップロードしました。あいことばは0000です。 http://whitecats.dip.jp/up/download/1578526409/attach/1578526409.png X軸がGFPで、細胞は骨髄です。 GFPがものすごく高い細胞が、私の興味対象です。 見切れてしまっているところに矢印を付けましたが、わかりますでしょうか...＞

(無題) 削除/引用 No.8545-6 - 2020/01/09 (木) 08:07:36 - TK-1 一つのピークというのはプロットの真ん中あたりに出るんですか、それとも端に出るんですか？ Divaのdata collectionは何もしなくても全てリニアスケールの数値です。それをログで表示するかリニアで表示するかはソフト上の設定の問題で、それで個々のイベントのとの数値が変るわけではありません。ゲートをどうしようが、関係ありません。 単にデータコレクションの際に、voltageを上げすぎているだけでは。どうやってvoltageを設定したんですか？もしこれが原因なら、とってしまったデータでどうこうするのは無理ですよ。100 kgスケールの体重計で、200kgと300kgのものの比較をできないのと一緒です。

(無題) 削除/引用 No.8545-5 - 2020/01/08 (水) 23:56:54 - FlowJp emaさん、ありがとうございます。 LSR2を使用しています。

検出装置は？ 削除/引用 No.8545-4 - 2020/01/08 (水) 15:54:18 - ema FCMの実際の装置は？ 最近BDは使ってないから忘れましたが、BCのサイトメーターは取得時にH(Liner）とL(Log-Hight)を両方選択しておけば、流しているときのPlotはlogにしておいてもFlowJo解析の時にどっちもできるのですが。

(無題) 削除/引用 No.8545-3 - 2020/01/08 (水) 01:40:30 - FlowJp TK-1様 ありがとうございます。 実験の都合で、赤血球よりも小さいmicroparticlesと骨髄白血球が含まれるようにゲートをしたいため、FSCとSSCをどちらもログにして、microparticlesの集団の左下からFSC／SSCプロットの右上にうんと引き延ばしたゲートを作製しています。 この方法だと良くないのでしょうか... FSC/SSCをどちらもリニアにして、FSCやSSCのthresholdを200くらいにしてデータ取得すればこのようなことは起こらなかったのでしょうか...。 ボルテージはどちらもリニアにしていた時と同じ値を用いています。

(無題) 削除/引用 No.8545-2 - 2020/01/08 (水) 01:18:37 - TK-1 voltage settingが高すぎてsaturateしているんじゃないんですか。

FlowJoでの解析で強い蛍光の集団が切れてしまう 削除/引用 No.8545-1 - 2020/01/07 (火) 13:25:36 - FlowJp いつも拝見させてもらっています。 FlowJoで、細胞表面タンパク質の発現解析をしていますが、 一部のサンプルにおいて、FSCが250k以上のものは全て一つのピークに圧縮されてしまっています。PEもやはり250k以上のものは全て一つのピークに圧縮されてしまっています。 これはなぜなのでしょうか？ 表示でなにかをいじると圧縮が解除できますでしょうか？ ご存知の方がいらっしゃいましたら、どうかよろしくお願いします。

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