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Nano Drop RNA トピック削除
No.8533-TOPIC - 2019/12/29 (日) 09:27:11 - あい
Nano dropでRNA濃度を測定しているのですが、抽出したRNAをそのまま測定する場合と1:50で薄めて測定するので260/280が変化します。
薄める方が260/280が低下します。

なぜなのでしょうか？
どなたかご教授いただけますと幸いです。
　
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No.8533-6 - 2020/01/03 (金) 02:04:22 - おお
まず原液と１：５０って随分大胆だなとおもいます。Nano dropのダイナミックレンジは広いとは思いますが、そのレンジに収まっているかなど少し危惧します。２６０が収まっていて２８０が収まってないかもしれないし。またダイナミックレンジ内であってもODというのは原理的に広いダイナミックレンジを得るのは難しい測定法です。例えばOD２では照射した光量の１００分の１しか検出されませんし、０．０２と０．０２５では９５．５と９４．４％で光量の差は僅かです。

またAPさんの指摘のように溶液に含まれるもので260/280は変化します。ですのでキットや精製法、サンプルによる何らかの持ち込みの影響を少なくするために、そしてpHを一定にするためにある程度の希釈（ダイナミックレンジのほぼ中央あたりのOD値になればいいのかなと想像します）をしてやるのがいいかと思います。

ちなみにEDTAは260/280を持ち上げると聞いたことがあります。もしかしてRNAの溶出、または溶解をTEでやっているなら、希釈することによりEDTAの濃度が下がり260/280が下がったのかもしれません。いずれにしろ260/280は目安でしかないので、１．８だろうと１．９だろうと下流の実験（分子生物学でよくやられるものであれば）に支障をきたすことはないと思ってます。

(無題) 削除/引用
No.8533-5 - 2019/12/31 (火) 08:52:14 - AP
> 260/280は2.0が良いという参照値があるかと思いますが

微妙に正しく理解されていない様ですが、

適切な溶媒で純粋なRNA標品のRatioを取ると、実測値が2付近になるという事実から、RNAサンプルの純度の目安にされているのです。Molecular Cloningなんかにはその辺の歴史的経緯やfactの解説記事が載っていたはず。

希釈前であろうと後であろうと、不適切な溶媒で測った値が、2だったとか、低かった高かった言っても意味がないです。ついでに言うと、純粋なRNAなら2になるってだけで、2だから純度の高いRNAであるということを保証するものではありません。

で、あなたのRNAが何に溶けているのか、希釈に何を使っているのかもわかりませんから、どの値がより適切かなんて言えませんよ。ちゃんとコントロールした条件で測り直したらいいだけじゃないですか？

私はいつも取得したRNA溶液を少量(1-2 uL)取って適当なバッファーで10倍希釈したもので測定します。それならば原液の溶媒がなんであれ再現性の良く測定できますし、測定を繰り返す必要がある時にも原液を減らさなくていいし、余りを泳動して定性的なチェックに回すこともでき、1 uLの原液を有効に利用できます。
また、カラム系のキットには溶出液に吸光度に干渉を与えるものもあるようなので
その影響を回避するのにも有効です。

(無題) 削除/引用
No.8533-4 - 2019/12/31 (火) 03:45:11 - あい
素晴らしい論文ですね。
260/280は2.0が良いという参照値があるかと思いますが、これと比較する際に、
希釈前と希釈後のどちらのRNAで参照値と比較するのが良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.8533-3 - 2019/12/29 (日) 14:23:15 - AP
AGPC法でお馴染みのChomczynskiが指摘した論文があるんですが、案外知らない人が多いようで、

核酸のratio260/280はpHやイオン強度に影響されるので、正しく測るにはpH8-8.5程度の適当なバッファの溶液で行う必要があります。ratioのブレは純水などで希釈していてpHが下がったりしてるんじゃないですか？

https://www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/97223st01

(link変更しました)

Nano Drop RNA 削除/引用
No.8533-1 - 2019/12/29 (日) 09:27:11 - あい
Nano dropでRNA濃度を測定しているのですが、抽出したRNAをそのまま測定する場合と1:50で薄めて測定するので260/280が変化します。
薄める方が260/280が低下します。

なぜなのでしょうか？
どなたかご教授いただけますと幸いです。
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