Bio Technical フォーラム

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RFLP法での予期せぬバンド出現 トピック削除
No.8531-TOPIC - 2019/12/27 (金) 17:03:50 - intestinalis
細菌の16S rRNA遺伝子をPCRで増幅し、アガロースゲルにて泳動後、EtBrで染色し観察する実験をやっております。
その際に、遺伝子配列から予測されるバンドの他に、遺伝子配列から予測されないバンドが頻繁に出現します。そのバンドは予測されるDNA断片の一番大きいものよりも大きいサイズの領域に1〜2本程度出現してきます。バンドの濃さは予測されるものに比べ薄いです。複数の菌種でこのような現象が見られていて、その菌に特異的な予測されないバンドが再現性高く出てきます。

16S rRNA遺伝子が複数コピーある細菌で、それぞれのコピーが違う配列の場合にこのようなことが起こりうるのかとも考えましたが、コピー間の相同性はかなり高いようなので、これによるものでもないのかと考えています。

考えられる原因として何か思い当たる方がいらっしゃいましたらご教授いただきたいです。よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8531-3 - 2019/12/28 (土) 09:51:38 - AP
過剰なPCRで産物の重合が起こっているのかも

(無題) 削除/引用
No.8531-2 - 2019/12/27 (金) 19:17:43 - ちき
RFLPということはPCR後に制限酵素消化しているのですよね。消化が不完全になっている可能性はないですか?
また、単一の細胞でrDNAコピー間の相同性が高いのは確かですが、完全に同一とは限りません。intragenomic heterogeneity rRNA genesなどで検索してみてください。

RFLP法での予期せぬバンド出現 削除/引用
No.8531-1 - 2019/12/27 (金) 17:03:50 - intestinalis
細菌の16S rRNA遺伝子をPCRで増幅し、アガロースゲルにて泳動後、EtBrで染色し観察する実験をやっております。
その際に、遺伝子配列から予測されるバンドの他に、遺伝子配列から予測されないバンドが頻繁に出現します。そのバンドは予測されるDNA断片の一番大きいものよりも大きいサイズの領域に1〜2本程度出現してきます。バンドの濃さは予測されるものに比べ薄いです。複数の菌種でこのような現象が見られていて、その菌に特異的な予測されないバンドが再現性高く出てきます。

16S rRNA遺伝子が複数コピーある細菌で、それぞれのコピーが違う配列の場合にこのようなことが起こりうるのかとも考えましたが、コピー間の相同性はかなり高いようなので、これによるものでもないのかと考えています。

考えられる原因として何か思い当たる方がいらっしゃいましたらご教授いただきたいです。よろしくお願いいたします。
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