BioTechnicalフォーラム [サザンのメンブレン白抜け]

サザンのメンブレン白抜け

No.8529-TOPIC - 2019/12/26 (木) 08:24:52 - か

いつもお世話になってます。
現在ゲノムDNAを制限酵素処理し、サザンブロットを実施しています。
目的バンド（18k）は検出されたのですが、DNAを流した全てのレーンが2kあたりで白抜けしています（ウェスタンのタンパクオーバーロードしたときのアルブミン焼けみたいな感じです）。電気泳動後のゲル写真をみてもそこにゲノム消化断片がエンリッチしている様子はありません。また制限酵素を変えても同様な現象がおこりますが、白抜け度合いは、制限酵素の種類によって変わります（2kにちょっと白抜けだったり、2-3kに渡って白抜けだったり範囲がかわります）。ゲノム量をふっても白抜けは認められました。
同様の経験をされた方いましたらアドバイスをお願いします。

条件は以下です。
DNAは、フェノクロエタ沈したものを使用
トータル10ug消化、エタ沈後泳動
トランスファーはアルカリトランスファーo/n
メンブレンはナイロンメンブレン
UVクロスリンクにて固定 60000x100マイクロj/cm2
digのキット（ロッシュ）
ハイブリ、washは、68度
　

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No.8529-10 - 2019/12/26 (木) 19:41:40 - か

エクストラな話ですが、、、
クロスリンクのし過ぎはないでしょうか？
どなたか経験ありませんか？

(無題)

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No.8529-9 - 2019/12/26 (木) 19:39:48 - か

うどんげさん
表現が悪かったかもしれません。エタチン後のエタノール残留を気にしてローディングダイを大目にいれています。
ローディングダイを大目に入れることでトランスファーに影響を及ぼす可能性あはるのでしょうか？

おおさん
その条件であれば、DNA濃度を減らせば無くなるはずですが、なくなりませんでした。他になにか考えられませんでしょうか？

(無題)

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No.8529-8 - 2019/12/26 (木) 16:55:09 - おお

トランスファーされたDNA（WBだと蛋白）がブロッキング効果があり周りよりバックグランドが低く白抜けして見えることがあるます。

(無題)

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No.8529-7 - 2019/12/26 (木) 16:02:30 - うどんげ

メンブレンが白抜けということは，メンブレンの当該箇所にブロットされている意図しない何かに標識抗体が直接または間接的に吸着しているだろうと想像したのですが

ブロットされ得る何かとは
・消化産物中の何か（たとえばバッファ中の保護剤のようなもの）
・染色色素（Et-Br ならおかしなことにならない。除外）
・SDS（新しいものなら単体ではおかしくならないと思う）
これらの複合物が予期しない挙動をとることもあるかなと考えました。

消化産物のエタ沈の残留とはどのようなものでしょう？　

DNA消化後エタ沈前にフェノクロ抽出するか，むしろエタ沈なしでいいような気がします。ウェル容量が足りなかったらコームにビニールテープなどを貼って厚みをつける工夫をします。白抜け対策の決め手としては確信ありませんが。。

(無題)

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No.8529-6 - 2019/12/26 (木) 12:25:36 - か

ありがとうございます。
ゲル染色はエチブロです。１０分染色後の水で20分洗ってます。
ローディングダイの組成をみると0.08%SDSがはいっていました。6xで使う所をエタ沈の残留が気になり、3xで使用しています。SDSの影響は大きいでしょうか？

RNase処理は十二分に行っているのでr RNAの持ち込みはないと考えてます。
また反復配列に関しては、違う制限酵素でカットしていてもでてくるので、違うのかと考えてます。

(無題)

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No.8529-5 - 2019/12/26 (木) 10:33:23 - AP

あとはそのサイズに落ちる、SINE、LINEのような反復配列があるとか。

(無題)

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No.8529-4 - 2019/12/26 (木) 10:30:06 - AP

rRNA除去は十分でしょうか？

(無題)

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No.8529-3 - 2019/12/26 (木) 10:27:10 - うどんげ

あと，loading dye に SDS が入っているかなど。