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高分子量タンパク質のWestern blot トピック削除
No.8526-TOPIC - 2019/12/24 (火) 17:12:45 - 棒茶
みなさま

些細な？ことかもしれませんが、御一読いただけると幸いです。

タンパク質Aは約200kDaほどの高分子量タンパク質です。
このタンパク質に50kDa程度の大きな機能タグを付与したコンストラクトを発現させました。
発現チェックのためWestern blotを行いタグに対する抗体を使用してタンパク質量を見てみたところ、210kDaを示すマーカーよりも下方に明瞭なバンドが形成されました。
(非発現細胞のライセートを流したレーンには存在しないバンドのためnon-specificなものではないと思われます。)

タンパク質Aをcloningする際のPCRでは目的のものに近しい塩基数が示されました。

浅学ではありますが、タンパク質Aがプロセシングを受けるなどした報告はないようです。

高分子量領域のWestern blotなのであまり重く受け止めておりませんでしたが、
気持ち悪さをこの頃感じております。

こうしたことが起こりうる理由、
タンパク質Aの要因、Western blot自体の要因など、
気付かれた点がありましたら、お教えいただけると嬉しいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.8526-4 - 2019/12/25 (水) 11:15:17 - ws絵drftgyふj
当該タンパク質に対する抗体でimmunoblottingしましたか。

cDNAのシーケンスも含めコンストラクトのチェックもしましょう。

tagを使って当該タンパク質をaffinity精製し（~200KDaのそのバンドがCBB染色で見え流くらいになれば部分精製でもいいです）バンドを切り出してLC-MS/MSで分析してみることはできますか。

こうした方法で、とりあえず、実験上の問題点がないらしいということになれば、以下の可能性について検討ください。

SDS-PAGE は理論値にほぼ近い比較的正確な分子量を知ることができることが多いですが、それでも様々な要因（塩基性あるいは酸性アミノ酸がとても多いなど構成するアミノの酸組成の偏り、翻訳後修飾、など）に影響されて、理論値の分子量位置とは（時にかなり）異なる移動度を示すこともしばしばあります。
またシグナルペプチドの除去や前駆体から成熟型フォームへの変換（Pre/ pro体の配列で遺伝子を発現させる→タンパク質としてはプロセシングを受けて成熟型で発現）に伴う限定分解などで一部が除かれて分子量が小さくなったこともあり得ます。文献情報からそうした可能性を示唆する知見はあるかどうか精査してみてはどうでしょうか。これらはエラーによるものでなく元々の当該タンパク質の性質によるものですので、たとえ分子量が予想と違っても、本来の姿をみているということで良いと思います。

(無題) 削除/引用
No.8526-3 - 2019/12/25 (水) 08:23:55 - おお
>タンパク質Aは約200kDaほどの高分子量タンパク質です。

200kDaはどのようにして出した数字ですか？

もしそのタンパク質の抗体が売っているなら買わずともカタログでWBイメージなど見つかると思いますがそういうものでマーカーと比べどれくらいの大きさとして検出されていますか（論文などで示しているものでもいいです）？

ゲルの濃度はどれくらいですか？

２１０kDａのマーカーの前後のマーカーは何kDａですか？

＞このタンパク質に50kDa程度の大きな機能タグ

タグだけの発現であなたの電気泳動システムでどれくらいの大きさとして検出されますか？

(無題) 削除/引用
No.8526-2 - 2019/12/24 (火) 17:45:27 - み
cDNAの全長をシーケンスすべきでしょう。
内部がスキップしたスプライシングバリアントとかあるかも。
最悪全く違う遺伝子をクローニングした可能性も否定できない。

タグがN末ならC末が切断されている可能性

高分子量タンパク質のWestern blot 削除/引用
No.8526-1 - 2019/12/24 (火) 17:12:45 - 棒茶
みなさま

些細な？ことかもしれませんが、御一読いただけると幸いです。

タンパク質Aは約200kDaほどの高分子量タンパク質です。
このタンパク質に50kDa程度の大きな機能タグを付与したコンストラクトを発現させました。
発現チェックのためWestern blotを行いタグに対する抗体を使用してタンパク質量を見てみたところ、210kDaを示すマーカーよりも下方に明瞭なバンドが形成されました。
(非発現細胞のライセートを流したレーンには存在しないバンドのためnon-specificなものではないと思われます。)

タンパク質Aをcloningする際のPCRでは目的のものに近しい塩基数が示されました。

浅学ではありますが、タンパク質Aがプロセシングを受けるなどした報告はないようです。

高分子量領域のWestern blotなのであまり重く受け止めておりませんでしたが、
気持ち悪さをこの頃感じております。

こうしたことが起こりうる理由、
タンパク質Aの要因、Western blot自体の要因など、
気付かれた点がありましたら、お教えいただけると嬉しいです。
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