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(無題) 削除/引用
No.8514-3 - 2019/12/19 (木) 10:00:18 - asan
>その”可溶化力の弱い界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?

>それだけの細胞ペレットを”たった1mlの界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?


そもそも、”真か偽か”なんていう表現は科学的に客観的ではないし、的を得てない表現だと思う。あなたは何を持って真だとか偽だとか言えると思うんですか?

”可溶化力の弱い界面活性剤”というのや、”たった1mlの界面活性剤”というのもあくまで何かに対する”弱い”とか”たった”とかいう相対的なものなので、その量では無理だと考える合理的根拠がなければ単にいちゃもんつけてるだけでしょう。

例1:変性能の弱い界面活性剤”のみ”でしか見えない結合は、生物学的に意味のある結合ではなくてノイズを拾ってるにすぎないのでは?
>結合の有無は結局、KD値の違いでしかなく、弱い結合であってもバックグラウンドレベル以上であればそれに意味がないという合理的根拠はないし、実際に界面活性剤の違いによって剥がれてしまう結合がないとも言えない。そもそも、ウエスタンとかのブロッキング試薬の違いだって結局は結合力のS・Nでバンドが見えた見えてないを議論してるだけの話

例:15cmディッシュ5枚の癌細胞セルラインは、何mgのペレットに相当するので、1mlのLysis bufferに十分に溶解できるとは思えないから実験として成立してないのではないか
>1%Triton X−100程度では核膜なんかがほとんど壊れないので、溶出されなかった部分の大部分は捨てただけの話かもしれない

真か偽かという絶対的基準をそれだけの事実でどうこういうが的を経てないというのはそういうこと。一般的な現象論として、生物学的に意味のある現象とは考えにくいのでは?というあなたの経験に基づく主張というだけの話でしょ?

(無題) 削除/引用
No.8514-2 - 2019/12/19 (木) 07:33:45 - おお
>その”可溶化力の弱い界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?

>それだけの細胞ペレットを”たった1mlの界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?

真かそれとも偽かをそれだけで判断にはむりがあります。結合しているだろうという他の根拠、結合していると考えたときにそれと符号する実験結果をふまえて判断していくものだと思います。

ジギトニンで信用できるかというなら、ジギトニンでタンパク質の複合体を見ている実験すべてを否定できますか?

>15cmディッシュ5枚の癌細胞セルラインをたった1mlの1%Triton X−100でライセート

細胞を回収してきてデタージェントなしでその細胞のボリュームと同等から2、3倍ぐらいの低張液で細胞を壊したときの上澄みをS100といい、それをつかってデタージェント抜きでIPするような実験も組み立てられるのだから、とりあえず頭から否定的にならないほうがいいとおもいます。細胞の中のタンパク質の濃度を再現しようとすると、Lysateは得られた細胞の容積と一緒のLysate液を作ることになります。

タンパク質間相互作用と界面活性剤について。 削除/引用
No.8514-1 - 2019/12/19 (木) 07:10:06 - nana
昨日、こんなセミナーを聞きました。

あるタンパク質Aとあるタンパク質Bが状況証拠から結合または同じ複合体内に存在しているという可能性にたどり着き、条件検討を重ねた結果、”最も可溶化力の弱いジギトニン”で細胞を溶解し、両者の結合を免疫沈降にて同定できた、という内容でした。

その”可溶化力の弱い界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?


もう一つ。前にいたラボでは15cmディッシュ5枚の癌細胞セルラインをたった1mlの1%Triton X−100でライセートを調製し、免疫沈降を見ていた人がいました。

それだけの細胞ペレットを”たった1mlの界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か?


コントロールとしては絶対に結合しないであろうと思われる分子に対する抗体でウエスタンするのは必須だと思います。例えばアクチンやGAPDHなんかでもいいかもしれません。


十分に細胞が可溶化されているかどうかの判断は難しそうです。

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