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(無題) 削除/引用 No.8514-23 - 2019/12/21 (土) 12:43:05 - ちき > digitoninってミトコンドリアは壊さないですってがっこで習ったんだが、 cardiolipin含量の差で外膜を選択的に壊すと習いました。実際にやった経験はないです。

(無題) 削除/引用 No.8514-22 - 2019/12/21 (土) 03:06:54 - おお 質問者の本題と外れてしまっていて恐縮ですが >digitoninってミトコンドリアは壊さないですってがっこで習ったんだが、 1959年の論文ですけど、、、、 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0014482759901995?via%3Dihub ジギトニンで細胞膜に穴をあけてミトコンドリアの基質を送り込みミトコンドリアの活性を測る手法はあります。トリッキーな方法でジギトニンが多いとミトコンドリアもやられてしまうようです。

qwぜxtvbyぬ７jみ８k９尾０ 削除/引用 No.8514-21 - 2019/12/21 (土) 01:52:09 - クァウェsXrdtfy７g 『digitoninを用いてミトコンドリアフラクションを”選択的に”溶出するってプロトコール。』 →digitoninってミトコンドリアは壊さないですってがっこで習ったんだが、最近のdigitoninはミトコンドリアも溶かすようになったのか。隔世の感があるな。

(無題) 削除/引用 No.8514-20 - 2019/12/20 (金) 13:43:57 - nana anan様、み様 ＞ま、一般性の低い特定の細胞の特定の条件でしか確認できない結合ならば、よっぽど繊細な実験をしたから初めて明らかになった事実なのか、それ自体が整合性を取るためだけの際どい実験なのかと言う話でしょうけどね。 ＞しかし1000gで核除去しただけなら、ミトコンドリアなんかもほぼintactな構造で溶液中に浮遊してるのかなっと想像するし、それで免疫沈降ってどうなの？と思うけど、 そうですそうです、まさにそれが伝えたかったことです。 ごめんなさい、私の言葉足らずが元々の原因ですね。 はい、細胞膜での2分子のたんぱく質の相互作用を見ていました。 哺乳類動物の培養細胞株で、です。 詳しくコメントくださり、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8514-19 - 2019/12/20 (金) 12:44:11 - み >[Re:15] nanaさんは書きました : > み様 > > 言及していませんでしたね。 > 膜タンパク質を対象としていました。 > > その発表の後データを出した人と話しましたが、ジギトニンで細胞を懸濁した後、氷上でしばらく置いた後、1000gで脱核して、その上清をPNS（post nuclear supernatant）としていましたね。 > しかし、そのデータを出した人はジギトニンで処理した1000gのPNSから免疫沈降したと言っていました。 結局どこの膜蛋白なのか未だに分からん。あなたの昔の実験はERなのは分かった。 しかし1000gで核除去しただけなら、ミトコンドリアなんかもほぼintactな構造で溶液中に浮遊してるのかなっと想像するし、それで免疫沈降ってどうなの？と思うけど、おそらく書き込まれた情報が不足してるだろうから真偽を問うことはできない。 他の人のコメントの　それ以上でもそれ以下でもないってのがしっくりくるな。 > ＞だいぶん頭が硬いですね。 > > この一文は相手に不快感を抱かせるだけですよ。 > 科学的な討論の場にこの一文は必要ですか？ 0か100かみたいなコメントされていたのでね。しかし謝ります、すみません。

(無題) 削除/引用 No.8514-18 - 2019/12/20 (金) 12:22:05 - asan >つまり私の理解では1000gでは核は落ちるが、膜ドメインは落ちないという理解です。 私が膜分画を取った理由は、ゴルジ体膜に局在する酵素の活性を評価することでしたので、取った膜画分を1％トリトンX100でその後膜画分から可溶化していました。 しかし、そのデータを出した人はジギトニンで処理した1000gのPNSから免疫沈降したと言っていました。 状況がよくわからんのですが、digitoninを用いてミトコンドリアフラクションを”選択的に”溶出するってプロトコールは一応ありますよ。 結果を疑いだしたらなんでもキリがないですが、少なくとも分画してるならばそれ相応のポジティブコントロールで分画できているかとかやってると思うんですけど、そういう話ではないのかな？ dish 5枚がどうってのは正直ペレット量とか細胞にもよると思うしね。 疑いだしたらキリがないけど、それであなたとしてはその人のデータに対して不信感をもってて総じてデータが信じられないというならそれ以上でもそれ以下でもないかと。 >発表者らの目的は、2つのタンパク質が結合するのではないか、という仮説があったので、その仮説を支持するような処理があまりに恣意的すぎないかと思ったのでここでトピックを立てました。 要するに、目的に応じて条件を変えて結合を見て結合してますしてませんはどうなの？という話かな。でもそれを言い出したら、サンプル条件を変えたり、ウエスタンや免疫染色の抗体ー抗原反応の条件変えたえりするのもいいの？とかきりがないとおもうけどね。 ま、一般性の低い特定の細胞の特定の条件でしか確認できない結合ならば、よっぽど繊細な実験をしたから初めて明らかになった事実なのか、それ自体が整合性を取るためだけの際どい実験なのかと言う話でしょうけどね。

(無題) 削除/引用 No.8514-17 - 2019/12/20 (金) 12:13:56 - おお >ちなみに核を溶出する必要がなければできるだけマイルドな条件にして核膜を壊さない方が実験上よいことも多い。DNAが溶出してくると粘性がでるのでハンドリングしづらくなるし、それでソニケーションすれば物理的結合に当然影響がでるしね。 強い抽出条件（たとえばRIPA）でも５ｍMほどのMgCl2を加えとくと意外とDNAは沈殿して除けます。またグラスビーズを入れておくとガラス（シリカ）とDNAの親和性が高いのでDNAにグラスビーズが巻き込まれて遠心するとDNAが底に来るのでLysatesがどろどろになるのを防げる場合も多いです。

(無題) 削除/引用 No.8514-16 - 2019/12/20 (金) 12:13:47 - nana anan様 ＞ちなみに核を溶出する必要がなければできるだけマイルドな条件にして核膜を壊さない方が実験上よいことも多い。DNAが溶出してくると粘性がでるのでハンドリングしづらくなるし、それでソニケーションすれば物理的結合に当然影響がでるしね。 ＞同様に、細胞内結合のco-IPをするなら長時間ビーズと撹拌する人がいるけどそれも基本的には悪さすることの方が多い。抗体ー抗原反応なんて数時間も回せばほとんどの場合十分だから、下手にオーバーナイトとかすればどんどん生理的な結合が外れる可能性が増える。 私は免疫沈降にあまりいい経験がありません。 もちろん誰がやってもうまくいくような抗体を使った場合にはその限りではありませんが。 ソニケーションで核内で結合している2者間の結合はやはり乖離してしまうものでしょうか？ 私も今後核たんぱく質の免疫沈降を行う予定ですが、1％Triton X100で細胞を処理したのちに、ソニケーションしてゲノムを破砕し、5000gで遠心した上清から免疫沈降をすることを考えていました。 anan様のソニケーションに関する一文に懸念をいだきました。 ソニケーションを行わないとすると、1％TritonX100単独で可溶化した上清から免疫沈降すればいいのでしょうが、ソニケーションなしでは十分に目的のタンパク質が可溶性分画に出てきているかが不安です...。

(無題) 削除/引用 No.8514-15 - 2019/12/20 (金) 12:08:04 - nana み様 言及していませんでしたね。 膜タンパク質を対象としていました。 その発表の後データを出した人と話しましたが、ジギトニンで細胞を懸濁した後、氷上でしばらく置いた後、1000gで脱核して、その上清をPNS（post nuclear supernatant）としていましたね。 私は膜画分を取る実験を数年前に行いましたが、その時には細胞をデタージェントを使わずにパンクさせた後、1000gだったかで脱核したあと、その上清を200000gで膜分画を取りました。 つまり私の理解では1000gでは核は落ちるが、膜ドメインは落ちないという理解です。 私が膜分画を取った理由は、ゴルジ体膜に局在する酵素の活性を評価することでしたので、取った膜画分を1％トリトンX100でその後膜画分から可溶化していました。 しかし、そのデータを出した人はジギトニンで処理した1000gのPNSから免疫沈降したと言っていました。 発表者らの目的は、2つのタンパク質が結合するのではないか、という仮説があったので、その仮説を支持するような処理があまりに恣意的すぎないかと思ったのでここでトピックを立てました。 ＞だいぶん頭が硬いですね。 この一文は相手に不快感を抱かせるだけですよ。 科学的な討論の場にこの一文は必要ですか？

(無題) 削除/引用 No.8514-14 - 2019/12/20 (金) 11:26:13 - み >[Re:13] あのさんは書きました : > 横からですが、 > > 多分トピ主はライシスバッファーが少ないことできちんとタンパク質が脂質二重層から抜け出ていなくて、なのにそのタンパク質に対する抗体でIPするとそのタンパク質も落ちてくるし相互作用を期待してたものも落ちてくるだろうし全くもって無関係なタンパク質も落ちてくるのでは？と言いたいだけだと思う。そう言う意味では完全に可溶化しておく必要がないというのは私は同意し兼ねます。膜ドメインごとごっそり落ちてるんじゃ？と私も思う。 コメント有難うございます。あのさんとは科学的な話ができそうだ。 ターゲットが膜蛋白とも核蛋白とも言及されてなかったと思うので話が逸れていますが、蛋白濃度濃すぎたりして非特異的に沈降する危険性は増しますよね。でも超遠心しとけばその条件で可溶化された画分で実験できる。 まあ誰も沈降実験だけのデータで全てを語る人なんていないだろうし、読み手も質は見抜けますよね。学生さんにはまだまだ難しい話でしょうが。

(無題) 削除/引用 No.8514-13 - 2019/12/20 (金) 11:13:27 - あの 横からですが、 > その条件で可溶化された画分で相互作用が見られただけと言っています。誰も完全に可溶化されたとは言っていないし、完全に可溶化しないといけない必要はない。 > 見たい蛋白とくにbaitが効率良く可溶化されていれば良い。関係のない画分はむしろ邪魔になるかもしれない。 多分トピ主はライシスバッファーが少ないことできちんとタンパク質が脂質二重層から抜け出ていなくて、なのにそのタンパク質に対する抗体でIPするとそのタンパク質も落ちてくるし相互作用を期待してたものも落ちてくるだろうし全くもって無関係なタンパク質も落ちてくるのでは？と言いたいだけだと思う。そう言う意味では完全に可溶化しておく必要がないというのは私は同意し兼ねます。膜ドメインごとごっそり落ちてるんじゃ？と私も思う。そしてそういう人に限って論文中には不十分な可溶化の状態でIPしました、とは書かないですよね。ほとんど多くの論文に再現性が見られないのはこういうところから来てると思いました。

(無題) 削除/引用 No.8514-12 - 2019/12/20 (金) 11:12:30 - asan >何か勘違いされてるかと思いますが、1% Triton-X100では核膜は可溶化されますが。 ここでの議論の趣旨とは違うので、あえて言うのもどうかと思ったが、 確かに１％で核膜が壊れないは言い過ぎでしたね。 でも0.5％程度ならDNAまでは溶出しないですよ。 ちなみに核を溶出する必要がなければできるだけマイルドな条件にして核膜を壊さない方が実験上よいことも多い。DNAが溶出してくると粘性がでるのでハンドリングしづらくなるし、それでソニケーションすれば物理的結合に当然影響がでるしね。 同様に、細胞内結合のco-IPをするなら長時間ビーズと撹拌する人がいるけどそれも基本的には悪さすることの方が多い。抗体ー抗原反応なんて数時間も回せばほとんどの場合十分だから、下手にオーバーナイトとかすればどんどん生理的な結合が外れる可能性が増える。 細胞内のタンパクどうしがin vitroでくっつくことは濃度的にありえないと思うから長時間やったからといって結合してくることなんて基本的にはないと思う。

(無題) 削除/引用 No.8514-11 - 2019/12/20 (金) 10:53:28 - み >[Re:10] nanaさんは書きました : > 仮にSDS入りのバッファーで結合することが確認されたとして、貴方はの「（in vivoでは出会う機会が無い」と言い切る根拠はなんですか？ だいぶん頭が硬いですね。 個々の結果の真偽を判断するには多面的な検証が必要と言っています。検証の一つとして局在を検討することがあります。その結果、出会う可能性がないと判断されることは多々あります。勿論、生理的には出会わないはずの蛋白が病的な状態では局在変化して相互作用したりしることがあるから、それを示すのも検証の一つだし、結合の意義を示す傍証。 > 不十分なら、それは「可溶化」とは言わないでしょう。 その条件で可溶化された画分で相互作用が見られただけと言っています。誰も完全に可溶化されたとは言っていないし、完全に可溶化しないといけない必要はない。 見たい蛋白とくにbaitが効率良く可溶化されていれば良い。関係のない画分はむしろ邪魔になるかもしれない。 シャーレ5枚を1mlのbufferでと聞いただけで勿論下手くそで何も分かっていない人が実験したのだろうと思うけど、その条件で再現性良く結合したならそれも実験的にはそうなるのだろうというだけで、重要ならさらなる検討をすれば良い。 > それから、1％triton x100では核膜は可溶化されますよ。 > きちんと考えて発言してください。 これは僕のコメントじゃないけど、横から反論しとくと、Tx100でも核蛋白は抽出される。核膜の一部もﾐｾﾙになるだろう。

(無題) 削除/引用 No.8514-10 - 2019/12/20 (金) 10:19:18 - nana >逆にSDS入りのbufferであろうが細胞内局在の全く異なる（in vivoでは出会う機会が無い）蛋白が、溶液中で結合することだってあるけど、どう思うの？ 仮にSDS入りのバッファーで結合することが確認されたとして、貴方はの「（in vivoでは出会う機会が無い」と言い切る根拠はなんですか？ ＞不十分であろうがその条件で可溶化された画分では「共沈が観察された」だけ。何も他に言えない。 不十分なら、それは「可溶化」とは言わないでしょう。 それから、1％triton x100では核膜は可溶化されますよ。 きちんと考えて発言してください。 おお様、 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8514-9 - 2019/12/20 (金) 09:14:51 - み >[Re:7] nanaさんは書きました : > >ジギトニンで信用できるかというなら、ジギトニンでタンパク質の複合体を見ている実験すべてを否定できますか？ > > だれがそんなことを言いましたか？ > 私がジギトニンでの複合体を否定するなんていいましたか？ > どこまで貴方は人を不愉快にさせるんですか？ セミナーを聞いての感想文や、先輩の実験の一例を挙げて思慮に欠いた感想文を書き込んでいる方が人を不愉快にさせる。直接演者や先輩に疑問を投げかけるなり重要なら自分で検討するなりして納得いく結論を得たら良い。個々の真偽なんてｹｰｽﾊﾞｲｹｰｽでたった一側面の実験では何とも言えないって皆さん口を揃えて言っているよね。

(無題) 削除/引用 No.8514-8 - 2019/12/20 (金) 09:13:49 - おお 誤解がある書き方をしてしまってすいませんです。 実際にDigitoninで可溶化して蛋白複合体をIPやその他の方法で同定、検出、単離している実験は探せば色々ありますよと申し上げたかったのです。なのでお示しのタンパク質Aとタンパク質Bの蛋白複合体の検出に限って否定的に見ているのはなぜかなと思った次第です。 実例などをいくらか上げておきますので、それらとご自身での調査で総合的に見てあなたの中で信用できないと思えるならそれはそれで構いませんのでいろいろな例など見てみたらどうですか？ www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/mtp001bul.pdf The Mitochondrial Protein Immunoprecipitation (IP) kit also provides choices of detergents, n-dodecyl-β-D-maltoside, TritonX-100, and digitonin, to achieve different stringency conditions for protein-protein interaction studies. Triton X-100 is the most commonly used detergent, especially for membrane protein solubilization. However, in case of fragile complexes digitonin or n-dodecyl-β-D-maltoside is the detergent of choice. www.cell.com/cell-reports/pdfExtended/S2211-1247(17)31802-8 Figure 3. ...(B) Digitonin-solubilized membranes from wild-type (WT) HEK293 cells or a HEK293 cell line containing an N-terminal 33Flag-tagged TMCO1 allele wereanalyzed by anti-Flag immunoprecipitation, sucrose cushion, and western blotting. //info.gbiosciences.com/blog/immunoprecipitation-protocol-critical-parameters Antigen extraction: ...The antigens should be in a physical form in order to allow its separation from other cellular components. Hence, extraction with nondenaturing detergents such as Triton X-100, Nonidet P-40, CHAPS, digitonin, or octyl glucoside can allow the exposure of epitopes in the antigen for better binding with antibodies. Some of these detergents can even preserve weak protein-protein interactions, for example, digitonin. //pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.jproteome.7b00599?src=recsys また、前の繰り返しになりますがデタージェントなしでLysateを抽出することもあり、膜タンパクでなければ弱いデタージェントでもIntereactionを見るのに十分なものもあります。 更に加えますが、目的の蛋白がどの程度抽出されるかにおいては、強いデタージェントで効率よく抽出されるが蛋白相互作用も切られてしまうなら抽出効率が悪くとも相互作用を温存できる弱いデタージェントを使うということもあり得る選択です。

(無題) 削除/引用 No.8514-7 - 2019/12/20 (金) 06:13:19 - nana >ジギトニンで信用できるかというなら、ジギトニンでタンパク質の複合体を見ている実験すべてを否定できますか？ だれがそんなことを言いましたか？ 私がジギトニンでの複合体を否定するなんていいましたか？ どこまで貴方は人を不愉快にさせるんですか？

(無題) 削除/引用 No.8514-6 - 2019/12/19 (木) 22:03:29 - あws絵drftgyふじ 基礎的な免疫沈降実験やタンパク質間相互作用についての分析についてご自身ではあまり経験されていないように感じました。一度、勉強した上で既知のもので良いのでご自身で一度IP実験を一通り経験されてからの方がより意義のある議論になると思います。 免疫沈降による相互作用解析の結果があてになるかできるかどうかは １. 使用する抗体が特異性の面で信頼できること。 2. 免疫沈降に使う抗体と同じ由来動物のIgG （クラスが違えばそれに応じてIgA, IgM, IgEーーーー）を等量使ったNegative control実験を並行して行い、結果を比較してconntaminantsとbona fadeを識別すること。(ただ最近はアミノ酸安定同位体の利用や非標識での定量的proteomics技術の急速な進歩で、精製度の低いサンプルでもLC-MS/MSの分析で大量のcontaminanntsの中からでも本物を識別できるようになってきていますので、昔ほどIPでの純度に注意を払う必要は必ずしもないようです。) 3. Pull-down assayで結果を検証すること。（できればIPに使用した抗体とは別のメーカーのものが良い） の３点をクリアすることと思います。 多くの生化学実験がそうであるように、以下のような多くのlimitationもあることはわかってください。 １。相互作用の多くはしばしば極めて動的なもので、私たちが見ているのはそのスナップショットにすぎないかもしれないこと、 ２。得られた結果はあくまでもある実験条件のもとでの結果であり、その条件では捕まえられなかった分子もたくさんあるだろうし(通常のIPの条件では容易に解離してしまうものも多いことも予想される）、条件を変えれば見えなくなる分子もあるかもしれず、示された結果は非常に限定的なものであるかもしれないこと。 3. 一般的な免疫沈降では対象分子との相互作用が直接か間接かはわからないこと。標的分子とパートナー候補分子のリコンビナントを使って調べることもできるが、しばしば別の分子が仲介している可能性もあり、この検証も限界がある。 4. タグ付きタンパク質などの強制発現系ではしばしばhspなどの分子シャペロン関係の分子がパートナーとして同定されてくることがある。相互作用していることは事実だが、これは変なものをたくさん発現したことで細胞がこれを異常たんぱく質として認識して対処しようとした結果か、もともとそうしたものと相互作用をするのかわからず、解釈にあたっては慎重にならざるを得ない。それもあって論文投稿すると内在性のものでみるように言われる。 追記 実験系を設定する際に、絶対結合しないであろう分子などというものは誰にも想定できません。例えばactinと直接あるいは間接的に相互作用する分子などいくらでもあります。

(無題) 削除/引用 No.8514-5 - 2019/12/19 (木) 17:45:41 - み >[Re:1] nanaさんは書きました : > その”可溶化力の弱い界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か？ 逆にSDS入りのbufferであろうが細胞内局在の全く異なる（in vivoでは出会う機会が無い）蛋白が、溶液中で結合することだってあるけど、どう思うの？ > それだけの細胞ペレットを”たった1mlの界面活性剤”で見た免疫沈降は果たして真かそれとも偽か？ 不十分であろうがその条件で可溶化された画分では「共沈が観察された」だけ。何も他に言えない。 > コントロールとしては絶対に結合しないであろうと思われる分子に対する抗体でウエスタンするのは必須だと思います。例えばアクチンやGAPDHなんかでもいいかもしれません。 他の蛋白が共沈してなくても、上記のin vivoで出会う機会が無い蛋白が結合しちゃった偽陽性など否定できず、何の足しにもならない。 真偽を確かめるには局在や機能的な多面的な検討が必要。 > 十分に細胞が可溶化されているかどうかの判断は難しそうです。 見たい分子複合体の可溶化効率を検討すれば良い。残渣にどれだけ残っているのか見れば十分かどうかは見えてくる。でも可溶化効率を高めるために厳しい条件で抽出すると、相互作用が外れる危険性が高まる。

(無題) 削除/引用 No.8514-4 - 2019/12/19 (木) 15:21:57 - mon ＞1％Triton X−100程度では核膜なんかがほとんど壊れないので、溶出されなかった部分の大部分は捨てただけの話かもしれない 何か勘違いされてるかと思いますが、1% Triton-X100では核膜は可溶化されますが。

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