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初代培養 トピック削除
No.8504-TOPIC - 2019/12/17 (火) 10:33:22 - 初代培養
ヒト臍帯血由来MSCの初代培養に挑戦しているのですがうまくいきません。
文献を参考にして、リンパ球分画をシャーレ上に播種しています。その際の培地はDMEM/F12+10%FBS+2mM L-Gln+Penicillin/Streptomycinを使用しています。

培養3日目ではコロニーのようなものが見られたのですが、この時点での培地交換（全量交換）以降、このコロニーも死んでいってしまいました。

何か培養方法で工夫できること（シャーレにコーティングを施す等）や、培地交換のコツ（半量交換や初回培地交換の時期）についてご教授いただけないでしょうか。
　
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(無題) 削除/引用
No.8504-7 - 2019/12/21 (土) 07:36:27 - 初代培養
mon様

ご回答ありがとうございます。
コートは何を使用されていたのですか？ゼラチンでしょうか？
またとある薬剤については一般的なものでしょうか？複数文献を探していると時々特殊な因子が入っているのを見かけますが、こういったものがクリティカルに効いてる可能性があるのですね。

(無題) 削除/引用
No.8504-6 - 2019/12/21 (土) 07:35:13 - 初代培養
MSC様

ご回答ありがとうございます。
専用培地の使用も検討してみます。シャーレは6 wellプレートの1区画を使って培養をはじめました。最初は細胞の塊が見られたのですが、2日目に培地交換をした後から調子が悪くなった印象です。ご指摘のように培地が変色するぐらい増えてから交換するというのはポイントかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.8504-5 - 2019/12/19 (木) 23:41:27 - mon
コートした方がいいですよ。
私はしていました。
あと、ある薬剤を加えることで劇的に生存が高まります。

MSCの初代培養 削除/引用
No.8504-4 - 2019/12/19 (木) 18:37:09 - MSC
何種類かのMSCを培養したことがありますが、培養方法がはっきりと確立された細胞でないのでしたら、MSC専用培地を使ってみることをお勧めします。少し高いので、増やす時だけでも使えばどうでしょうか？

それから、ご存じかもしれませんが、MSCは何代か継代すると元気がなくなって増えなくなります。実験は初めに十分増やして細胞を準備してから行うほうがいいと思います。

培地交換は培地の色が変わるくらい十分増えてからした方がいいと思います。毎日細胞を顕微鏡で観察して、増殖していることを確認してください。

どのくらいの大きさのシャーレを使っているのかわかりませんが、スケールを小さくして細胞濃度が10の5乗オーダー以上で始めた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.8504-3 - 2019/12/17 (火) 11:09:54 - 初代培養
おお様

私が拝見している中ではDMEM/F12に10%FBSを加えているものが多くあったため、そちらを基本としました。
血清濃度は効果あるかもしれませんね。あとおお様のご意見として、初代培養時は初回の培地交換のタイミングはどれぐらい経ってから、全量または半量交換した方がいいなど経験的にございますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.8504-2 - 2019/12/17 (火) 10:56:21 - おお
ぐぐって斜めに読んでいくと、デキサメタゾンを培地に加えて血清を２０から３０％にしているものを見かけます。培地はDMEM　Low Glucoseを使っているようです。

まあバリエーションはあるかと思いますが、今お使いの培地に落ち着いた経緯とかあるのですか？

初代培養 削除/引用
No.8504-1 - 2019/12/17 (火) 10:33:22 - 初代培養
ヒト臍帯血由来MSCの初代培養に挑戦しているのですがうまくいきません。
文献を参考にして、リンパ球分画をシャーレ上に播種しています。その際の培地はDMEM/F12+10%FBS+2mM L-Gln+Penicillin/Streptomycinを使用しています。

培養3日目ではコロニーのようなものが見られたのですが、この時点での培地交換（全量交換）以降、このコロニーも死んでいってしまいました。

何か培養方法で工夫できること（シャーレにコーティングを施す等）や、培地交換のコツ（半量交換や初回培地交換の時期）についてご教授いただけないでしょうか。
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