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(無題) 削除/引用 No.850-7 - 2012/08/22 (水) 02:11:16 - 直輝 10%DMSOで凍結するのでDMSOは細胞に無害だと思ってしまうかもしれませんが、それは間違いです。 もちろん細胞によるけど、1%DMSOでも細胞障害性が出たりする。 （LDHアッセイとかをやってみればわかる） 0.1%DMSOなら、まず問題ない。 起こした細胞 1mL ＋ 培養用の培地 10mL ↓ チューブのフタをして、ゆっくり２、３度まぜる ↓ 遠心して、上清を捨てる ↓ 培養用の培地を加えて懸濁し、普通より濃いめにまく 自分はこんな感じでやってます。

(無題) 削除/引用 No.850-6 - 2012/08/22 (水) 00:17:47 - tail 皆様、早急なレスポンス有り難うございます。新しい培地や凍結ストックを作る際の諸々の懸濁が不十分だとこのようなことが起こりうるのですね。いま一度手順を確認し、丁寧な操作を心がけるようにしたいと思います。 > あと、凍結保存液とかの培地への持ち込みが多いとよくない気がする、ていうか、昔、めんどうなので適当に培地に薄めてまいたら立ち上がりがすごい悪くなったことあった。今はちゃんとやってる。凍結保存細胞のけんだく液は一回はDMEM/FBSに希釈して洗った方がいい。 確認させて下さい、ストックを溶解後に一度スピンダウンして培地に再懸濁し、プレートするということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.850-5 - 2012/08/21 (火) 23:38:45 - (゜Д゜ 培養乙。FBSはフィブロネクチンとか、ビトロネクチンみたいな接着因子をいっぱい含んでいて、これが、培養の時の細胞の接着、伸展に働く事考えたら、FBS全然ないor少なすぎなら、（もしこういう接着因子を別途加えてなければ）接着はかなりしにくいというか、できないんじゃね。ある程度増えてくれば細胞自身も自分で接着因子とかバンバン作って分泌したりするから、無血清にしてもある程度まではいける（最終的には剥がれてきたりするけど24時間くらい（いやもっとか？）までなら行けることが多い。）けど、は種時はやっぱ難しいとおもうんだが。 抗生物質は、濃すぎると細胞は死んだり剥がれたりする。あとは種時に接着しにくくなる事もあるよ。 ただ、少ない分には別に問題ないとおもう。 あと、凍結保存液とかの培地への持ち込みが多いとよくない気がする、ていうか、昔、めんどうなので適当に培地に薄めてまいたら立ち上がりがすごい悪くなったことあった。今はちゃんとやってる。凍結保存細胞のけんだく液は一回はDMEM/FBSに希釈して洗った方がいい。

(無題) 削除/引用 No.850-4 - 2012/08/21 (火) 20:23:13 - 凍結 質問がの焦点がはっきりしないのですが、それはFBSをいれないと293Tはまずいです。 DMEM培地のロットはよほどクリティカルな実験を要しないかぎり、問題ないと思います。 想像としては、細胞ストックの溶かし方の条件、凍結の仕方が均一でないのが原因かもしれません。 もし、実験を続けていく上で本質的でない感じがするのなら、わたしなら違うことを気にします。

(無題) 削除/引用 No.850-3 - 2012/08/21 (火) 14:19:13 - Harmonia 用いているディッシュのロットは同じでも、同様の現象が起こす細胞のバイアル よっては起きてしまうのでしょうか？ HEK293を使っていて、ロット違いで張り付き方に差が出た経験があります。

(無題) 削除/引用 No.850-2 - 2012/08/21 (火) 09:20:26 - ~ >培地にFBSや抗生物質を入れ忘れるとこのようなことが起こるのでしょうか 質問はこの部分でいいのですよね。 コンタミネーション防止用の抗生物質を入れ忘れても、増殖が悪くなることはまずないかと思います。 FBSを入れ忘れたまたは添加濃度が少ない場合、増殖が極端に遅くなったり、細胞がディッシュに貼り付かずに死ぬこともありますので、今回のようなことが起こりえます。 他の細胞は順調に育っていたというのであれば、FBSの完全な入れ忘れではなく、量が少なかったり、FBSを溶かした後によく混ぜずに上層の薄い部分を添加したというのも考えられるかと思います。 また、同じロットの凍結細胞と書かれていますが、異なるバイアルが同時に同じ位置に保存されることはありませんので、たまたまダメージを受けているバイアルを使ったことも考えられるでしょう。 それと、日が異なるのであれば、インキュベーターが不安定で、温度や炭酸濃度がたまたまおかしいときにあたっとも考えられます。

細胞の凍結ストックに関するトラブル 削除/引用 No.850-1 - 2012/08/21 (火) 08:42:31 - tail 先日、293Tの凍結ストックを起こして10cmの10% FBS in DMEMに播いたところ、cellのアタッチメントが非常に遅く、コンフルエントになるまで4日ほどかかりました。翌々日に293細胞の凍結ストックを他の人からもらうことがあり、同じ培地を用いてプレートしたところ、同様の現象が起きました。293T, 293ともに細胞が起きるまで時間がかかりましたが、一度コンフルエントになってスプリットしてからはgrowthに問題はありません。 また別のときに、上記293Tと同じロットのストックを起こしたところ、今度は播いて24時間の時に既に40%ほどの細胞が接着している様子が観察されました。このときは新しく調製した（と言っても抗生物質と10%FBS,　DMEMを混ぜるだけですが。FBSは同じロットを分注しています）DMEMを使いました。 上記の経緯から、293T, 293で最初にgrowth rateやアタッチメントが遅かったのは、そのとき使用した培地に原因があるのでは、と考えています。しかし、同じ培地をHeLaや293の安定発現株の培養にも使っていましたが、増殖に影響するトラブルはありませんでした。 培地にFBSや抗生物質を入れ忘れるとこのようなことが起こるのでしょうか。ご教授の程よろしくお願い致します。

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