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(無題) 削除/引用 No.8497-12 - 2019/12/18 (水) 08:49:32 - み >[Re:11] サンタクロースさんは書きました : > 自作できる抗体はポリクロなのでおそらく結果はそう変わらないのかなと思っています。各社のポリクロがことごとく駄目な状態です。どこを配列にするかで変わる可能性はありますが。 > > モノクロの一つで有望な候補が出てきました。 抗原ペプチドなんて幾らでも違う部位が候補として作製できるだろうから資金があれば当たりを引けると思うけど。たいがいN末付近かC末付近が上手くいきやすいだろうけど。 試薬会社の抗体なんて半分もworkしないだろうし内在蛋白の染色はWBより難しくなるのは周知の事でしょう。 そもそも抗原賦活化条件を数種類試しているのだろうか。何でFFPEと同時に通常のPFA固定だけとかでも反応性をチェックしないのかなあと思う。それで反応性を示したらあとは同じ抗体で賦活化条件を最適化すれば良いだけだろうに。逆に言えば生の細胞をPFAやMeOH（最悪無固定とか？）で試して染まらなかったらFFPEなんて適用できないと思う。

(無題) 削除/引用 No.8497-11 - 2019/12/18 (水) 08:09:08 - サンタクロース 自作できる抗体はポリクロなのでおそらく結果はそう変わらないのかなと思っています。各社のポリクロがことごとく駄目な状態です。どこを配列にするかで変わる可能性はありますが。 モノクロの一つで有望な候補が出てきました。

(無題) 削除/引用 No.8497-10 - 2019/12/17 (火) 10:18:23 - asan >また、マウスの検体で予備的な実験はできないのでしょうか？ 自分もそれは思いました。ただ、マウスとヒトでクロスリアクトする抗体かどうかはやってみないとわからないことはありますからね。 実験的にヒトサンプルで染色することがクリティカルな研究テーマなら、思い切ってヒトのサンプルでしっかりワークする抗体を自作することも考えてもいいんじゃ無いかと思ったり。いいか悪いかよくわからない抗体を何個も買ってあれこれやってるぐらいなら、最近は思い切って作ってしまっても時間もコストもそんなに変わらない気もします。

(無題) 削除/引用 No.8497-9 - 2019/12/17 (火) 05:50:05 - おお >原因は詳細には分かりませんが、そのたんぱく質の発現量が極めて少ないことが知られています。 ならその細胞と、発現が認められている細胞で比較をされてはどうでしょうか？過剰発現は評価する上で考慮することが複数ありますし。 また、マウスの検体で予備的な実験はできないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8497-8 - 2019/12/17 (火) 05:19:00 - サンタクロース 現在実験が上手く行っているように見えるcell lineにおいては、が抜けていました。

(無題) 削除/引用 No.8497-7 - 2019/12/17 (火) 03:10:09 - サンタクロース 原因は詳細には分かりませんが、そのたんぱく質の発現量が極めて少ないことが知られています。

(無題) 削除/引用 No.8497-6 - 2019/12/16 (月) 22:15:56 - おお >ネガコンでは陽性細胞は0です。ポジコンでは、陽性細胞が10−15%ほど これはエンドが染まらないという事ですか？エンドが染まらない抗体がどれほど意味があるとお考えでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8497-5 - 2019/12/16 (月) 08:44:06 - み 状況がだんだん分かってきました。 導入細胞と非導入細胞で染め分けができているなら（タグ抗体でも陽性細胞の染まり方が同じ）強制発現レベルの蛋白は検出できるということで良いでしょう。 しかしcell line（細胞種）が違うとノックアウトラインでもべったりと染まるということは、細胞種や賦活の違いによってはクロスリアクトする危険性があるということですね。 やはり段階を踏んでそれぞれの抗体に関して条件を振って検討し、何に使えて何に使えないとか、どのシグナルが特異的なのかなど自身で見極めていかないといけない。 FFPEはハードルが高いから、まずは単純な系でスクリーニングして、その系でワークしない抗体は賦活化を頑張ってもFFPEで出るシグナルって特異的なの？ってのが僕の懸念なんです。 最終的にFFPEで使えないと意味がないってのは分かるんですけど。

(無題) 削除/引用 No.8497-4 - 2019/12/16 (月) 01:22:43 - サンタクロース 目的は、ヒトの多検体で評価することなので、全く同じ方法で抗体の評価をするとなると、FFPE化することになり、これが客観的指標と考えています。 蛍光染色でPFAなど異なる固定法で評価するとなると全く実験系が異なると判断しました。逆に蛍光染色ではうまくいくのに、FFPEでうまくいかないなら、実験がワークしていないので、ヒトの多検体でもうまくいっていないものと考えることになるかと思います。 ややこしいのは、市販の白血病由来 knockout cell lineも試したのですが(上記の実験とは全く臓器の異なるcell lineです)、こちらはcell lineの性質のためか、いずれの抗体もべったり全体が染まってしまいます。 一方過剰発現したcell lineでは、タンパク質のlocalizationが完全に目的の位置と一致しています。

(無題) 削除/引用 No.8497-3 - 2019/12/15 (日) 22:06:26 - み トランスフェクトした培養細胞をFFPE化なんて普通はしないと思うけど。 抗体によって賦活化を工夫しないと強制発現といえど反応しないだろうし、敢えてハードル上げていることになる。 単純にPFA固定して蛍光染色した方が良い。ﾄﾗﾝｼﾞｴﾝﾄで導入してるなら陽性細胞と陰性細胞が同時に観察できるだろう。内在蛋白を検出できるかは次元の異なる話だから、それに関しては第二のスクリーニングが必要でしょう。ﾉｯｸﾀﾞｳﾝしてシグナルが消えるとか特異性を検証するなり。 しょぼい人は染色してシグナルが出たらそれが内在蛋白を検出していると思っちゃうけどね。

(無題) 削除/引用 No.8497-2 - 2019/12/15 (日) 21:15:08 - asan それだけだと、transientで入ってる細胞全てが染色できてるのかはわかりませんけど、一応筋は通ってるとしか言いようがないでしょう。通常そういうやり方をするなら、GFPやHAなどのタグを入れておいてそちらではちゃんと光ってる細胞が染色できてるかまでは見ると思います。 通常抗体のメーカーの保証を依頼する場合は、過剰発現レベルでの染色を保証してるならそれで十分ですけど、エンドに対して染色がうまくいくことをうたった抗体の場合は、ノックダウンやノックアウトではほとんど出ない染色が見えるかどうかで決着つけることが多いです。

遺伝子過剰発現細胞の免疫抗体染色 削除/引用 No.8497-1 - 2019/12/15 (日) 13:01:18 - サンタクロース ヒト多検体である遺伝子の発現量を見るために、各社の抗体の妥当性を評価していますが、なかなかいい抗体がないために、苦戦しています。 ウエスタンに関しては、販売元で評価がある程度なされているため、直接染色での評価を行っています。もちろんウエスタンが本当にワークしているか100%信用できるか評価が分かれると思いますが。 抗体のpositive及びnegativeコントロールとして、とあるcell lineを使用しています。 目的のタンパク質をtransientに過剰発現させるために、リポフェクタミン2000でトランスフェクションして、蛍光染色ではなく、FFPE化し、スライド上で評価しています。 transfectionした細胞としていない細胞で差が出る抗体を探していたのですが、10種類ほど試してようやく、差があるものが出ました。具体的には、ネガコンでは陽性細胞は0です。ポジコンでは、陽性細胞が10−15%ほど出ているのですが、これで抗体がワークしていると判断していると判断して問題ないでしょうか？

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