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CD4-creでKOされるのにCAG-creERではKOされない トピック削除
No.8493-TOPIC - 2019/12/13 (金) 12:02:52 - ぺ
困っているのでアドバイスを頂けると幸いです。
ある遺伝子を時期特異的にT細胞でKOしたいのですが、CAG-creER,geneA f/fマウスからT細胞を取ってきて4-OHT処理しても、KOがgenomic PCRで確認できません。このマウスにタモキシフェンを投与してもT細胞ではKOされていませんが、尻尾では完全にKOされています(genomic PCRで)。
一方、CD4-cre,geneA f/fマウス由来のT細胞では、KOがgenomic PCRで確認できます。
4-OHTやtamoxifenの濃度等は論文で一般的なものですし、当然、いくつかの濃度を試しました。CAG-CreERをヘテロにしているので、発現量を増やすためにホモにしようかと考えています。対処法・同じような経験など教えて頂けると助かります。
　
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No.8493-5 - 2019/12/14 (土) 06:12:34 - M
脾臓のT細胞は、ソートなどで分離した細胞を用いているのでしょうか？　in vitroの4OHT処理でも組み換えが起きないとなると、大変ですね。

とりあえず、
（１）分離したT細胞でのCreの発現確認（ウエスタンなど）
（２）免疫染色が可能であれば、4OHTによるCreの核移行チェック
（３）タモキシフェンを打ったマウスの胸腺細胞での組み換え確認
くらいやってみると、脾臓T細胞に特異的な問題か、Creの発現低下による問題か、情報が得られると思います。

もし可能なら、異なるfloxマウスと掛け合わせてチェックしてみれば、お使いのfloxアレルに特異的な問題かどうかも見当がつくでしょう。

もう１０年以上前になりますが、CAGにCreERをつないだマウス（トピ主さんのマウスと同じかどうかは分かりません）をflox のconditional knock-inと掛け合わせて、解析した経験があります。タモキシフェンの量はもう少し少なめで、４日間投与でした。組み換えの解析は６ヶ月後で行い、脾臓でも胸腺でも90%程度の組み換えが見られました。が、６ヶ月後に見られた組み換え効率は、投与直後の造血幹細胞や前駆細胞での組み換え効率を反映していた可能性があります。残念ながら投与直後での解析は行わなかったので、分化したT細胞での組み換え効率を直接見てません。あまり参考にならないかな？

(無題) 削除/引用
No.8493-4 - 2019/12/13 (金) 18:10:11 - ぺ
情報、有難うございます。

spleen由来のT細胞で、tamoxifenは2mg/20g(body weight)、コーンオイルに混ぜてipです。３−5日間連続投与しています。

(無題) 削除/引用
No.8493-3 - 2019/12/13 (金) 16:08:29 - 小言幸兵衛
このような論文がありました。

Developmental regulation of the composite CAG promoter activity in the murine T lymphocyte cell lineage.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19830820

"Despite the ability of the CAG promoter to drive gene expression in almost all tissues examined to date, its activity appears to be developmentally regulated within the T lymphocyte cell lineage. In particular, CD4 and CD8-expressing, thymic immature T cells displayed lower levels of the GFP marker when compared with both bone marrow precursors and mature circulating T cells, suggesting a transient downregulation of CAG activity during T cell development."

(無題) 削除/引用
No.8493-2 - 2019/12/13 (金) 15:04:27 - mutagenesis
面白いですね。そんなことが起こり得るんだ。
T cellsはどこの組織由来でしょうか？
tamoxifenはマウスのどこへ投与していますか？

CD4-creでKOされるのにCAG-creERではKOされない 削除/引用
No.8493-1 - 2019/12/13 (金) 12:02:52 - ぺ
困っているのでアドバイスを頂けると幸いです。
ある遺伝子を時期特異的にT細胞でKOしたいのですが、CAG-creER,geneA f/fマウスからT細胞を取ってきて4-OHT処理しても、KOがgenomic PCRで確認できません。このマウスにタモキシフェンを投与してもT細胞ではKOされていませんが、尻尾では完全にKOされています(genomic PCRで)。
一方、CD4-cre,geneA f/fマウス由来のT細胞では、KOがgenomic PCRで確認できます。
4-OHTやtamoxifenの濃度等は論文で一般的なものですし、当然、いくつかの濃度を試しました。CAG-CreERをヘテロにしているので、発現量を増やすためにホモにしようかと考えています。対処法・同じような経験など教えて頂けると助かります。
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