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(無題) 削除/引用 No.8492-10 - 2019/12/14 (土) 17:51:41 - Azsxdcfvgbyhnujimo@ TCAとか酸沈殿で行うとき、Histidine のリン酸化みたいに酸性下では不安定な翻訳後修飾もあるので気をつけたほうがいい。酸沈殿後はacetoneなどの有機溶媒で２回くらい遠心洗浄すると、中和処理しなくて済むことが多い（完全に乾かすと非常に溶けにくくなるので注意）。 TCA沈殿物をサンプルにするにしてもSDS sample bufferで可溶化した後は特別な理由がなければ通常の電気泳動のように加熱するので、質問の表題と、TCAかそれ以外の方法かということとはあまり関係ないと思う。

(無題) 削除/引用 No.8492-9 - 2019/12/14 (土) 02:18:53 - おお 蛋白の変性と調製している間の変化など少し整理して考える必要があると思います。 個人的にはTCAで処理するのもサンプルバッファーで処理するのもそんなに蛋白の分解やリン酸化の変化に差があるとは感覚的に思えないです。SDSは強力なタンパク変性剤である程度の量存在するだけでかなりの蛋白が不活性になるでしょう。もちろん即座に加熱することでよりその効果を高める事ができるでしょう。どうしてもSDSをつかったLysisでも蛋白分解、脱リン酸化が気になるならProtease inhibitors とPhosphatase inhibitorsを加えておくといいです。私は変性状態で蛋白を回収するときはHot lysis buffer（１％SDS、Tris HCl pH 8）を使い必要なら上記のInhibitorsを加えてます。これであればSample bufferと違って蛋白定量が容易ですので。 またSDSやTCAを使わなくとも、Protease inhibitors inhibitorsを使っていればそんなに心配でもないと思います（勝手な感覚ですが）。一番心配なのは刺激に対する反応が早い場合で、PBSで洗っている間にある程度進行してしまうのではないかとかそういうことだと思います。冷やしたPBSも温度的な刺激になる可能性もありますし。室温のPBSでも培養していた状態から変化するのは間違えないし（よく酸素濃度の変化でHif１などの検出に再現性が取れなくなるとか聞きます）。 TCAはそういう点では優れた方法ですが個人的にはTCAで得られた沈殿を再溶解するときにばらつきが生じることが多く（例えばあまりうまく溶かせてないときはアクチンが均一でもほかが溶けてないとか）、使いにくいなという感覚はあります。まあうまくワークしている人もいるようなのでやって様子を見てみてみればいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.8492-8 - 2019/12/13 (金) 16:04:54 - 小言幸兵衛 リン酸化エピトープは私の手ではTCA法の方がずっとconsistentな結果が出ます。刺激後30秒というtime pointが取れるのも魅力です。

(無題) 削除/引用 No.8492-7 - 2019/12/13 (金) 15:02:39 - s あと、煮ればいいってもんじゃないとほぼ同じprotocolがここにわかりやすく示されていますよ。 これは二次元電気泳動の話ですが、非常に参考になります。 DIGE 道場　第3回 できるプロのタンパク質抽出術 一助になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8492-6 - 2019/12/13 (金) 14:57:18 - s 煮ればいいってもんじゃ　さん 私がやっている方法は、煮ればいいってもんじゃのホームページに書いてあるとおりの方法ですよ。 氷冷10%TCAを細胞面が浸かるくらいに入れて、on ice 30分。 スクレイパーで掻き取って、5分遠心。 TCAをできるだけ捨てて、尿素/Triton/DTT溶液でタンパク再溶解して、ソニケーション。 10%のSDS溶液を入れて、TrisでpHを戻しておしまいです。 ＞定量制が失われたりしないか懸念があります むしろ、TCAによって固定して沈殿にしてから回収したほうが、細胞をlysisするよりも過不足なくタンパクを回収できていると思っています。

(無題) 削除/引用 No.8492-5 - 2019/12/13 (金) 13:28:12 - 煮ればいいってもんじゃ みなさん、ありがとうございます！ qqさん、無血清ではなく低血清（0.5％）培地を用いていますので、やはり洗浄はしたいですね...。 確かに私の操作は逆の方がいいですね！気づきませんでした...ありがとうございます！ クァwせdrftgyふさん、”プロテアーゼKみたいな)プロテアーゼが動物細胞のなかにそんなにあるとは思えないので、” この一文にとてつもなく安心しました！ありがとうございます！ sさん、なんと利用者さんでしたか！ 私も培養上清に分泌されたものを濃縮したいときにTCAアセトン法を使いますが、細胞のライセートの調製にはつかったことがないです。 sさんは、まずウェルを洗ったのち、10％TCAを1mlほど加えて、氷上15分、その後15分4度で遠心し、上清を捨てたのちに、冷アセトン1mlほどで転倒混和後に、10分遠心後、SDSサンプルバッファーで再溶解という手順でしょうか？ 手順が多いので、定量制が失われたりしないか懸念がありますが、全てのタンパク質が効率よくTCAで沈殿に回収されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8492-4 - 2019/12/13 (金) 12:21:18 - s 私も10%TCAで細胞を固定？した後に、再溶解する方法でwestern blottingのサンプルを調整しています。 以前は、RIPA bufferやlysis bufferを試したこともありましたが、TCA方法が最も安定していました。 sampleを濃く調整できるのも魅力ですね。 また、この方法を取れば、phos-tagアクリルアミドなどの特殊なものにもそのまま使えるのでとても重宝しています。

(無題) 削除/引用 No.8492-3 - 2019/12/13 (金) 11:35:12 - クァwせdrftgyふ 変性タンパク質がプロテアーゼで分解されやすくなるのはそのとうりですが、SDSの変性効果は基質だけでなく酵素にも及ぶわけで、2%のSDS中で(しかも基質になりうるような多数のタンパク質がある中で特定のものを壊すような)十分な活性が維持できるような(プロテアーゼKみたいな)プロテアーゼが動物細胞のなかにそんなにあるとは思えないので、そういうことが起こらないとは言わないけど、常に気をつけないといけないほどそこまで一般的な現象かどうかは???です。

(無題) 削除/引用 No.8492-2 - 2019/12/13 (金) 10:58:10 - qq >刺激後、冷PBSで2度洗ったら、 >1％トリトンX100/PBSで氷上15分放置後にスクレーパーでかき取り、 >遠心した上清にSDSサンプルバッファーを加えてボイルでした。 状況次第だと思います。 刺激するところで、血清などが入っている培地であれば、冷PBSで2度洗う必要があるかもしれないけれど、無血清培地で良ければ、冷PBSで2度洗いは不要になるかもしれない。 「氷上15分放置後にスクレーパーでかき取り、」のところは、逆のほうがいいんじゃない？と思います。 市販の硬いスクレーパーよりも、シリコンゴムの付いている柔らかいスクレーパーを使うほうが良いですし、培養ディッシュを使うべきで、培養フラスコを使わないほうが良いと思います。

煮ればいいってもんじゃ（ウエスタン） 削除/引用 No.8492-1 - 2019/12/13 (金) 10:37:08 - 煮ればいいってもんじゃ 先日、細胞ライセート調製を調べるために見つけたサイトを見ていて、なんでも煮ればいいってもんじゃないというタイトルでコラムがありました。 それによると、TCAでの速攻の調製法を勧めていました。 SDSサンプルバッファーでの調製では、中途半端にタンパク質が変性されると、残存するプロテアーゼがアクティブだった場合、中途半端に変性したタンパク質が分解されてしまうと書かれてありました。 通常は高次構造をとるためにプロテアーゼから保護されているけれど、というのが理屈でした。 ただ、膜タンパク質をSDS化する際には、37度で数時間ヒートしたりしますよね。 あの場合はプロテアーゼによる消化は起こらないのかなど、少しすっきりしません。 みなさんはリン酸化タンパク質や刺激してから数分で消失してしまうようなシグナルを見たい場合に、どういった方法でライセート調製されますか？TCAでしょうか？それともSDSサンプルバッファーを加えて、10分ほど氷上（でいいのかは謎ですが...）ののちにスクレーパーでかき取り、ソニケーションでしょうか？ どれがいいのかなと考えています。 ちなみにこれまで私は、刺激後、冷PBSで2度洗ったら、1％トリトンX100/PBSで氷上15分放置後にスクレーパーでかき取り、遠心した上清にSDSサンプルバッファーを加えてボイルでした。 ただ、これでは結果が安定せず、代案はないかと検索したら上のサイトを見つけました。

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