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(無題) 削除/引用 No.8482-6 - 2019/12/10 (火) 15:36:08 - ダブルカット 皆様有難うございます。 CIAP処理と連続シングルカットを試してみたいと思います。 MreI, MauBIともにクローニングではまず使われていないのですが、これらの酵素以外ですとインサートも切られてしまう状況です。

(無題) 削除/引用 No.8482-5 - 2019/12/10 (火) 14:08:51 - SYBR master Supercoil状態のplasmidを完全切断するのに必要なユニット数は、制限酵素ごとに違いがあります。例えば、EcoRVなら1 microgのplasmid完全切断に必要なユニット数は、1ユニットですが、XhoIなら10ユニット必要です。 今回の酵素で必要なユニット数は、ThermoScientificでしか販売していない酵素なので、直接聞かないと判らないですね。 取りあえず、シングルカット　⇒　ゲル抽出　⇒ シングルカット　⇒　カラム精製(16 baseはほとんど回収できない）で、私なら試してみます。

(無題) 削除/引用 No.8482-4 - 2019/12/10 (火) 14:06:05 - おお ごく微量でもシングルカットが存在するとセルフLigationのコロニーが結構出てくるので、念のため脱リン酸化したらどうでしょうか。 クローニングサイトのMreIとMauBIの間にユニークな制限酵素認識部位がないでしょうか？Ligationのあとその酵素でカットを入れとくとシングルカットのセルフLigationが除けます。 ＞あるいはMreI(cg ccggcg)とMauBI(cg cgcgcg)の配列が似ているのでCompatible endになっている 普通は配列が一致してなければCompatibleとは呼びません。 MreIやMauBIはどれほどこのようなクローニングに向いているか分かりませんが、そういう確認はしましたか？

(無題) 削除/引用 No.8482-3 - 2019/12/10 (火) 13:00:27 - ダブルカット どちらも新品を使っております。また、単一の酵素でカットチェックしてみましたが、どちらもカット出来ました。ですので失活しているということは無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.8482-2 - 2019/12/10 (火) 12:53:48 - 774 どちらかの酵素が失活してる可能性はありませんか？

大量のセルフライゲーションに困っています。 削除/引用 No.8482-1 - 2019/12/10 (火) 12:22:25 - ダブルカット いつも勉強させて頂いております。 現在プラスミドライブラリーを作製しているのですが、なかなか思うように進まず困っております。皆様のご助言を頂けると有り難いです。 以下のような条件で実験を行っております。 プラスミドのクローニングサイトにMreIおよびMauBIという制限酵素サイトを、とある事情から導入しました。MreIとMauBIは13bp離れています。 そしてこのプラスミドをMreIおよびMauBIで同時にカットし、電気泳動しカットされたものだけを単離しました。 その後、インサートもMreIとMauBIでカットし、T4 ligaseでライゲートしたのですが、インサート無しのNegative controlも大量にコロニーが生えてきてしまいます。(インサートありの場合と同じ量のコロニー数が生えてくる）。 制限酵素サイトが近接しているとダブルカットが上手くいかず、シングルカットになっており、セルフライゲーションが起こっているのかなと予想しています。この場合、シングルカット(MreI)　⇒　ゲル抽出　⇒ シングルカット (MauBI)　⇒　ゲル抽出　のように実験を行えば上手くいくものなのでしょうか？ あるいはMreI(cg ccggcg)とMauBI(cg cgcgcg)の配列が似ているのでCompatible endになっているのかなとも予想しております。 ご助言を頂けると大変ありがたいです。 どうぞよろしくお願い致します。

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