やってはいけないことと承知なのですが、3日ほどラボに行くことができなくなりました。
状況を説明させてもらいます。
まずPCRにて変異導入を行いました。Dpn1処理して、その後形質転換させ、大腸菌コロニーが50個ほど生えたので、その一部の4コロニーをピックアップしオーバーナイトでミニカルチャーを行いました。
ところがその翌日からラボを3日行くことができなくなり、そのため先輩にお願いし、37度で回しているミニカルチャーを4度に移動させておいてほしいとお願いしました。
ラボに戻ることができ、すぐにミニプレップを行い、シークエンスを行いました。
すると恥ずかしいことに4つ中、3つがオリジナルなものでした。Dpn1未消化体が残っていました。
残り1コロニーは目的の変異が導入されていましたが、目的のインサート（1kb）だったものがごっそり抜けおちていました。
実はこのインサートはくせものでして、repetitiveな配列や逆相補的な配列がそのインサート内に2つずつ含まれています。オリジナルなプラスミドは外注で全合成してもらったものです。
なぜこれが起きたのか、その原因を探索したいのですが、
1. 3日、4度で大腸菌を放置してしまったため、組換えなどわけのわからないことが起き、1kb脱落してしまった。
2. インサート配列の特殊性から、変異導入からすでにうまくいっていない可能性がある。
ちなみに変異導入の際に使ったオリゴとアンチセンスオリゴはrepetitiveな配列や逆相補的な配列を避けています。
非常にわかりずらい書き方かと思いますが、どうかコメントをくださいますと幸いです。 |
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