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(無題) 削除/引用 No.8472-6 - 2019/12/06 (金) 05:01:51 - mastermix Dohn Joeさん、カートン箱さん、情報ありがとうございます。 Q5の場合、酵素単独をちょっとケチって0.2 uL /25 uL reactionで使うと、1反応の単価が、酵素単品：2x Master Mixがちょうど1:2になり、dNTPの値段と手間とを考慮すると2xのでもまぁいいかなと思えていたんですが、変異導入はそこまで大量のサンプル数を捌く予定はないし、直接泳動にもっていくこともあまりないので、Dohn Joeさんの話もありますし、まぁ酵素単品を買うのでいいかな、と心を改めました。 カートン箱さんの話も興味深い知見です。ドツボにはまったら、サイクル数をいじるとか小手先のことで頑張らず、素直に酵素を変えるのが一番なのかもしれませんね。 試供品といえば、全然関係ない余談ですが、ずっと前、学会に参加したときに、これもちょうどQ5なんですが、NEBの人からサンプルをもらったんですけど、それがまさかの常温放置されてたものを室温手渡しでした。うっそーん、そんな訳ある？！と思ったんですが、当の担当者は、帰ったら-20Cに入れてもらえれば全く問題ないよと涼しい顔をしていました。結局数日間室温放置（あ、ホテルでは、念のため冷蔵庫に入れてた気もしますが）していたわけですが、帰ってからしばらくして、難しいテンプレートで使ってみたら、手持ちのどの酵素より強い増幅で、やるじゃんQ5と新鮮な驚きを覚えた記憶があります。 個人的には全般的にNEBよりThermoやPromegaの方が洗練されてる印象で好きなんですが、まぁPCRに関しては、どのHi-Fi酵素もノーマルTaqよりは十分優れている感じでしょうし、まずは安いのから試してみて、駄目なら別のにトライする、って形にしようかなと思います。 無駄話に脱線しましたが、情報どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8472-5 - 2019/12/05 (木) 14:34:13 - カートン箱 マスターミックスは凍結融解の繰り返しではあまりへたる印象がありません。冷蔵で長時間保存すると数か月でへたりが見えてきましたが。 また、Quickchangeについてですが、変異を掛ける部位によって上手く行かないことがあるようです。 私は普段PrimeSTAR HSで変異導入していましたが、PrimeSTAR HSやPfu ultrapureを使うとどうしても上手く行かない（反応産物をE. coliに入れてもコロニーが出ない）部位が有り、PfuUltra HFに変えると上手く行った経験ががあります。 変異導入位置が数bp違うだけで上手く行く行かないが変わったのでプライマー設計の問題があるかもしれませんが（導入部位のヘアピンやGC含量？）。 とりあえずありものの校正機能付きポリメラーゼで試してみて、どうしてもだめな奴は違うポリメラーゼで掛けるのはどうでしょうか。 ちなみに、せこい手ですが試供品を貰える製品もあるので、それで試すのもありかと。

"Hi-Fi酵素"の安定性 削除/引用 No.8472-4 - 2019/12/05 (木) 14:16:28 - Dohn Joe 挙げられた中の1つについて、増幅性能が顕著に悪くなったことが数回あります。 Taqのmaster mixだと同様の扱いで顕著な悪化は経験したことがありませんでした。 この経験からその"Hi-Fi酵素"のまとめ買いは避けておこうと思っています。

(無題) 削除/引用 No.8472-3 - 2019/12/05 (木) 08:10:17 - mastermix みさん、情報ありがとうございます。 やっぱり実際のところ、複数回の凍結融解程度でいきなり駄目になるなんてことはなさそうですね。熱にも強いTaqの面目躍如といったところでしょうか。 しかし、High-fidelityの酵素の場合でも、特にエラーレートが増えるなどの問題はなさそうでしょうか？ 実は私自身、特にHigh-fidelityとうたわれているProofreadingタイプではない、日常用途（Genotypingとか、増えればいいだけの用途）酵素のPCR mixでは10回以上の凍結融解で問題ないことを確認しているのですが、この度ちょっとHigh-fidelityのものもMaster mixを試してみようかなと思いまして、そういう奴らは伝統的なTaqより繊細な印象があるのでどうなんだろうな、と気になった次第です。 関連して、追加質問になってしまいますが、Site-directed mutagenesisでベクター全長をぐるっと増やすような形の増幅にも耐えうるようなHi-Fi酵素として、今のところQ5、KOD One、Pfu Ultra II、Phusion IIなんかを考えているのですが、この用途での具体的な使用雑感のある方いらっしゃいましたら、こちらも情報いただけると大変ありがたいです。 所属元からの購入では、Q5が一番安いのでQ5にしてみようかなと思うのですが、普通に使えそうですかね？？ （各社の「競合他社の製品との比較」を見ると、他社製品になった瞬間増幅効率がめっちゃ悪くなっててなんか笑えます）

(無題) 削除/引用 No.8472-2 - 2019/12/05 (木) 07:35:22 - み １０回くらいは試したことあるけど大丈夫

2xPCR master mixの凍結融解 削除/引用 No.8472-1 - 2019/12/05 (木) 06:39:31 - mastermix 最近はdNTP、Buffer、さらには泳動用のGreen dyeまで入ったPCR master mixがHigh fidelity酵素でも売られていて非常に便利なんですが、大容量のものを買った場合（25 mLとか）、流石に1回使い切り分で分注するのは大変です。 実際の運用上、凍結融解を複数回繰り返しても問題はないのでしょうか？ もちろん凍結融解自体が結構な手間なので、毎回25 mLを溶かして凍らせて…などはしませんが、例えば1 mLずつに分注して、その分注チューブは何度か凍結融解を繰り返して使う、というのはそこまで問題ないと考えてもいいんですかね…？ そんなもんメーカーに聞けという話かもしれませんが、メーカーに聞いても建前的な安全重視の答しか返ってこないように思われるので、実際に使っている方の意見が聞けたらなぁと思い質問してみました。 凍結融解はしない方がいいのは当たり前なんですけど、現実的にどんな塩梅か、使用雑感ある方のご意見を伺えたら幸いに思います。

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