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(無題) 削除/引用 No.8471-5 - 2019/12/05 (木) 14:45:42 - ちき なるほど。 off-target cre recombinaseで検索すると幾つか情報が出てくるようです。今回観察されたものと同様の現象についての記述なのかはわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.8471-4 - 2019/12/05 (木) 11:16:12 - pig 　御返信ありがとうございます。 以下回答させて頂きます。 1. 複数の細胞で全く同じようにloxP配列の消失を伴う標的の欠失が起きたのでしょうか。それともクローン化した後の解析? →今までに異なるcell lineで4回同様のシステムを用いloxP配列で挟まれた領域の切り出た経験がありますが、最初に行った3回は理論通りのloxP配列の残存を認めました。4回目の今回初めてこのような現象が起こりました。 今回のケースではCre酵素を使用した後、限界希釈後に24個のサブクローンを樹立した後に解析しました。その中の2クローンについて解析しましたが、この2クローンの両方で同じようにLoxpの残存がありませんでした。 限界希釈前のバルクでの解析はしておりません。 2. 欠失サイトの配列はどのようになっていましたか。(loxPは部分的に欠けているのか、丸ごときれいに欠けているのか、loxPを含むある程度の領域が欠けているのか。ジャンクション部に短いホモロジーがあったりするのか等。) →通常Cre酵素を用いた場合はloxP配列の1つがそのまま残存すると思いますが、今回のケースではloxP配列を完全に認めませんでした。また、前後の領域に異常な配列はなく切り出したかった領域と共に残存するはずのLoxp配列まで完全に切り出されたと推測される状態でした。ある意味ではLoxp配列が残存しなかっただけで目的は達成された状態とも言えます。

(無題) 削除/引用 No.8471-3 - 2019/12/05 (木) 06:12:16 - ちき 以外->以下

(無題) 削除/引用 No.8471-2 - 2019/12/05 (木) 04:44:19 - ちき 答えを持ち合わせている訳ではありませんが、以外の点が気になります。 1. 複数の細胞で全く同じようにloxP配列の消失を伴う標的の欠失が起きたのでしょうか。それともクローン化した後の解析? 2. 欠失サイトの配列はどのようになっていましたか。(loxPは部分的に欠けているのか、丸ごときれいに欠けているのか、loxPを含むある程度の領域が欠けているのか。ジャンクション部に短いホモロジーがあったりするのか等。)

Cre/loxPシステムについて 削除/引用 No.8471-1 - 2019/12/04 (水) 21:47:05 - pig 初歩的な質問で恐縮ですが、1つのDNA分子に2つのloxP配列を同じ向きに挟み、Cre酵素にて挟まれた領域の配列が切り出されるように設計した細胞を作成し、Cre酵素を用いて設計通りloxP配列で挟まれた領域の切り出しを試みました。 予定通り挟まれた領域が切り出されているのですが、理論上1つ残存するloxpの残存がありませんでした。細胞の取違いの可能性も考えSNP等でCre酵素処理前の細胞と同一であるか数か所checkしましたが、細胞の取違いはないという結果でした。 Cre酵素を用いて切り出した際に理論上残存するloxpが残存しない事が一般的に起こり得るものかどうか御存知の方がいれば、御教授頂ければ幸いです。

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