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タンパクの等電点と不安定性、保存バッファーについて トピック削除
No.8463-TOPIC - 2019/12/02 (月) 16:53:10 - ゆきあき
いつもお世話になっております。

タンパク精製後に保存用にバッファー交換をしているのですが、先輩から「等電点からずらしたバッファーで保存して」とお願いされたので、解析ソフト（clc sequence viewer 8とSwiss-Plotのサイト）でアミノ酸配列から等電点を計算しました。
すると、解析ソフトによって等電点が異なるので、どうしたらいいのか困っています。
私はclc sequence viewer 8を用いて計算し、バッファー交換していたのですが、先輩に「Swiss-Protの等電点計算値の方が正しい」と言われてしまい、今までの実験をやり直さなくてはならいのかと思って、落ち込んでいます。

例えばあるタンパクは、clc sequence viewer 8で計算すると等電点は8.42なので、NiキレートゲルのpH8.0のバッファーで精製後には、pH7.5バッファーに置換してタンパクを保存していました。
しかし、Swiss-Protの計算ですと、7.79となってしまい、先輩には怒られるし、バッファー交換しなければよかったと後悔しています。

解析ソフトの等電点はアミノ酸配列を用いた理論値だとはわかっているのですが、ソフトによって結果が異なってしまうので、一般的にはどのソフトまたはサイトを使うべきなのかご教授していただけないでそうか。

また、タンパクは等電点付近で保存するのは絶対にご法度なのですか？
今回、pH7,5のバッファー（20%グリセロール含有）で保存しましたが、沈殿することもありませんでした。
確かに長期間、等電点付近のバッファー中で保存するのは良くないとは思うのですが、そんなに等電点から保存バッファーをずらす必要があるのか疑問に思っています。

タンパク実験に関して勉強不足なのは重々承知しておりますが、何卒ご教授頂けると幸いに存じます。
宜しくお願い致します。
　
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全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.8463-14 - 2019/12/06 (金) 04:24:31 - おお
ちなみにある膜タンパクのコンプレックスをNativeで等電点電気泳動で精製しようとしたらpIあたりで沈殿したという話はあります。

56789様 解決済み 削除/引用
No.8463-13 - 2019/12/05 (木) 07:58:13 - ゆきあき
コメント、ありがとうございます。
そうなんです…
等電点に限らず、自分の理論(仮説含む)をぶちかまし、絶対に曲げない先輩なのです。
別の先輩に相談したら、とりあえず保存バッファーは言う通りのソフトで計算して、等電点からずらしたバッファーで保存しておきな〜、戦うな〜、と言われました。
こだわりは大事ですが、人の意見を聞ける人間でありたいと思いました。

(無題) 削除/引用
No.8463-12 - 2019/12/04 (水) 21:17:10 - ５６７８９
なんか等電点でトラウマになるような失敗をしたことがあるのかもね。うちらの職種は一つのことに（なにもそこまで？と思うくらい）ものすごくこだわる人がわりと多いからね。この傾向は時に成功につながることもあるし泥沼にハマる原因になることもあるしで厄介なんだが。物事は加減てか力の入れ方のバランスは大事かもね。

クァwzせxdcrvtびゅにmこ、lp様 削除/引用
No.8463-11 - 2019/12/03 (火) 22:56:05 - ゆきあき
コメントありがとうございます。

沈殿したら私でも、そのバッファーはマズいでしょ、と思うのですが、何事においても先輩は等電点、等電点で…
確かにSwiss-Protで計算していませんでしたが、保存中に沈殿するようなことはありませんでした。

等電点は確かに大切ですし、結果オーライで、沈殿や凝縮のリスク回避だとは思います。
これからはSwiss-Protでの計算値を使えば文句ないでしょ、という気分です。
ここに力を割くなら勉強と実験をします。
仰る通り、逆らわず、かつ皆が納得のいく方法を取るのが1番得策なんだと思いました。
ただ、今回の件で、自分の無知さを知り、大変勉強になりました。

本当に私の勉強不足です…

(無題) 削除/引用
No.8463-10 - 2019/12/03 (火) 22:22:30 - クァwzせxdcrvtびゅにmこ、lp
対象とするタンパク質の特殊な事情とか、実験目的からそのように言うならば何かあるんでしょうが、一般化して、タンパク質というものはpIを避けて保存しなくては、とか言ってるならば、機嫌損ねない程度に聞き流して良いように思います。等電点沈殿は、例えばカラム等電点電気泳動などで、非常に狭い空間にバンド状にものすごい高濃度に濃縮されるような特殊な条件下で起こることがありますが、溶液に保存中とかでは、起こしたくてもそんなに簡単に起こるものではないです。

toto様 削除/引用
No.8463-9 - 2019/12/03 (火) 19:09:09 - ゆきあき
はい、アミノ酸配列からの計算値です。
仰る通り、正しい等電点は実験しないと出ないですよね。

なるほど、Swiss-Protは立体構造からの表面荷電かもしれないですね。

ありがとうございます。

もっと勉強しなくては。

(無題) 削除/引用
No.8463-8 - 2019/12/03 (火) 14:54:12 - toto
等電点の理論値といっておられるのはアミノ酸組成からの計算値のことじゃないです？nativeな構造の表面荷電は容易に計算ではわかりません。Swiss-Protのはもしかすると立体構造からの表面荷電なのかもしれませんが。等電点沈殿は表面荷電がゼロになったときに起こりがちな現象で、これは構造がとかれてない場合には、実験的にnativeな状態で等電点を調べないとわからないはず、と思いますが。

おお様 削除/引用
No.8463-7 - 2019/12/03 (火) 07:51:54 - ゆきあき
そうですね。
リスクを避けるにはいい方法だと思います。

なぜ、解析ソフトによって、同じアミノ酸配列を入れても等電点が異なるかは、これから調べてみます。

ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8463-6 - 2019/12/03 (火) 07:24:28 - おお
＞先輩のなんでもかんでも等電点からバッファーのpHをずらさなくてはならない

結果オーライなので、等電点にちかいpHで沈殿してしまうリスクを避けるという話ならわからなくもないです。

おお様 削除/引用
No.8463-5 - 2019/12/03 (火) 06:05:23 - ゆきあき
なるほど。
等電点が中性付近でも保存バッファーも中性付近(もちろんタンパクの種類やバッファーの組成によると思いますが)で良い場合もあるのですね。
勉強になります。

とにかく、先輩のなんでもかんでも等電点からバッファーのpHをずらさなくてはならない、という考え方はおかしいと思うのですが、それを論破するだけの知識と証明する実験をすぐに行えない自分の無知さが情けないです。

(無題) 削除/引用
No.8463-4 - 2019/12/03 (火) 02:57:54 - おお
たとえば制限酵素のPstIはpIは計算方法等によるがほぼ中性付近

NEBの保存用バッファーは
Storage Conditions

250 mM NaCl
10 mM Tris-HCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
200 µg/ml BSA
50% Glycerol
0.15% Triton® X-100
pH 7.4 @ 25°C

https://www.neb.com/products/r0140-psti#Product%20Information

おお様 削除/引用
No.8463-3 - 2019/12/03 (火) 02:13:59 - ゆきあき
お世話になっております。
ご教授ありがとうございます。

あまりにも先輩が等電点を気にするので、自分で色々調べてみると、おお様の仰るようなことが分かってきて、疑問に思い、ここでご相談させて頂きました。
等電点がバッファー決定の全てではないんじゃないか？と疑問に思っていたので、コメント頂けて、すっきりしました。

また、仰る通り、それぞれのソフトの計算方法はどのようなものかは、今、調べています。
(まだ調べきれていません…)

いずれにせよ、ラボで使うソフトを統一し、それぞれのソフトの計算方法を明らかにしようと思います。

ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8463-2 - 2019/12/03 (火) 01:57:39 - おお
pIに近くなると必ず沈殿するわけでもありません（沈殿する傾向にあるとは言えるかもしれませんが）。また必ずしもpIから保存のためのバッファーのpHを決めるわけではありません。ただし構造などを決めたりいろいろなリコンビナントを作るようなラボではある程度の基準を作っているかもしれません（感覚的、経験的あるいは理論的なものをベースとした、流儀みたいなもの）。

＞私はclc sequence viewer 8を用いて計算し、バッファー交換していたのですが、先輩に「Swiss-Protの等電点計算値の方が正しい」

これもどちらを使うのかはラボや研究グループで決めておいたほうがいいので、そういうことなら原則それに従うべきです。正しいとか言われたらあなたは納得するためにまず何を確認しますか？


それぞれの計算方法ですよね。

タンパクの等電点と不安定性、保存バッファーについて 削除/引用
No.8463-1 - 2019/12/02 (月) 16:53:10 - ゆきあき
いつもお世話になっております。

タンパク精製後に保存用にバッファー交換をしているのですが、先輩から「等電点からずらしたバッファーで保存して」とお願いされたので、解析ソフト（clc sequence viewer 8とSwiss-Plotのサイト）でアミノ酸配列から等電点を計算しました。
すると、解析ソフトによって等電点が異なるので、どうしたらいいのか困っています。
私はclc sequence viewer 8を用いて計算し、バッファー交換していたのですが、先輩に「Swiss-Protの等電点計算値の方が正しい」と言われてしまい、今までの実験をやり直さなくてはならいのかと思って、落ち込んでいます。

例えばあるタンパクは、clc sequence viewer 8で計算すると等電点は8.42なので、NiキレートゲルのpH8.0のバッファーで精製後には、pH7.5バッファーに置換してタンパクを保存していました。
しかし、Swiss-Protの計算ですと、7.79となってしまい、先輩には怒られるし、バッファー交換しなければよかったと後悔しています。

解析ソフトの等電点はアミノ酸配列を用いた理論値だとはわかっているのですが、ソフトによって結果が異なってしまうので、一般的にはどのソフトまたはサイトを使うべきなのかご教授していただけないでそうか。

また、タンパクは等電点付近で保存するのは絶対にご法度なのですか？
今回、pH7,5のバッファー（20%グリセロール含有）で保存しましたが、沈殿することもありませんでした。
確かに長期間、等電点付近のバッファー中で保存するのは良くないとは思うのですが、そんなに等電点から保存バッファーをずらす必要があるのか疑問に思っています。

タンパク実験に関して勉強不足なのは重々承知しておりますが、何卒ご教授頂けると幸いに存じます。
宜しくお願い致します。
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