実験経験の浅いひよっこなので初歩的な質問になると思いますが、どうかご教示願います。
現在GsサブユニットをもつGPCRの活性を測定するためにcAMPの産生量を測定しております。これまではPromegaのcAMP-Glo Max Assayキットを用いて測定していたのですが教授からの指摘もありアブカムのcAMP EIA Kitを用いて測定しようとしています。
Glo MAxの時には培地を除去し、リガンドを溶かしたPBSを添加した後にそこに細胞溶解剤を加えた上清を回収し測定に用いておりました。
しかしEIAの場合リガンドを処理した後に培地を除去し-80℃で凍結することで細胞を破壊するみたいです。
そこで、これまでのようにPBSを用いてリガンド処理をしてしまうとその時点で細胞がはがれてしまいリガンドを除去すると細胞が減ってしまい困っております。
ふつうは培地に直接リガンドを添加するものなのでしょうか？
同じような実験をされたことがある方がいらっしゃれば実験の流れをお聞きしたいです。
ちなみに受容体は一過性で発現させており、処理するリガンドは脂質メディエーターおよびそれを抱合化したものになります。
他に必要な情報があればお聞きください。 |
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