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(無題) 削除/引用 No.8453-14 - 2019/11/29 (金) 03:01:11 - mutagenesis mutagenesisうまくいってました！ ゼオシン、カナマイシンプレートともにコロニーがバッチリ生えていました！ 今回少量の鋳型を用いてmutagenesisしたので、多くが変異体だと思います...！ ということで、たぶん当初していたカナマイシン原液をプレートに塗る方法では今回のプラスミドにとっては濃すぎて生存できなかったのかもですね。。なにはともあれ、これからシークエンシングのために増やします。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.8453-13 - 2019/11/28 (木) 20:39:12 - AA 一般的には培地に入れるカナマイシン濃度は25とか30ng/ulくらいだと思いますが(rocheのハンドブックなどには10-50ng/ulが使用濃度となっています) 25ng/ulでは全くコロニーが取れなかったので5ng/ulにしたら当たりのコロニーが取れた経験がありますので、カナマイシン濃度を下げてみるのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8453-12 - 2019/11/28 (木) 19:45:21 - AP site-directed mutagenesis やほかのコンストラクションのときもそうだけど、PCRでmutationが入るのを嫌って、サイクルを少なめでやるというのがスジではありますけど。

(無題) 削除/引用 No.8453-11 - 2019/11/28 (木) 18:24:06 - 小言幸兵衛 Stratageneのプロトコルって完全にcomplementaryな（stickyなはみ出し部分の無い）2本のプライマーを使うんですよね。あれだとchain reactionになっていないのでリニアにしか増幅しないから、産物の量は思ってるより少ないと思いますよ。 カナマイシン耐性のプラスミドをただ再形質転換するのに、0.1〜0.5μgあたり１個しかコロニーが出ないなら、反応産物でコロニーが出なくても不思議はないように思いますが。 カナマイシンの濃度が間違ってたりしませんか。さもなくば、回復培養の時間を延ばしてみるとか。

(無題) 削除/引用 No.8453-10 - 2019/11/28 (木) 14:21:45 - mutagenesis おおさん、 すみません、はい、だいたい10 ngですね。 PCR産物はtransformation効率が低くなるのでしょうか？ メチル化と関係あるのでしょうか？知りませんでした。 コンピはInoue法で作製したもので10^7ほどのものを用いています。 学部生に調製してもらったのでタイターは低いです。が、それでも大丈夫だと思うのですが・・・ 他の形質転換には問題なく使えていますので・・・ > PCRがうまく言ってないと申し上げたのはNickが入った環状DNAができて、その環状DNAから増幅するので環状DNAが増えるしくみになっているけど、うまく環状DNAが維持できずに平滑末端のDNAが出来上がってないかなど気がかりなところがあります。それが電気泳動で確認できますか？ ごめんなさい、おっしゃる意味を理解できていませんが、線状のプラスミドができているかどうかでしょうか？今ラボにいないので確認が取れませんが、ただ、PCRバンドは鋳型のバンドと同じ高さなので、環状ではないかと思います。 > 平滑末端が出来るようなプライマーにして、PCR　Productsをリン酸化（プライマーを先にリン酸化してもいいけど）、LigationしてTransformationするなら事がそこまで複雑にはならないのでそういうプライマーをデザインしなおすのも手かもしれません。 なるほど・・・確かにその方法もありますね・・・ ただ、quick change mutagenesisでこれまで特に問題が起きたことがないのでとても不思議です。 もう一つの懸念は、私はこれまでカナマイシン抵抗性のプラスミドのコロニーピックアップのトラブルがよくあります。ます今回のものもそうですが、Origeneからクローンを購入し、Kanamycin抵抗性遺伝子が乗ったpCMV6ベースのものでしたので、それを形質転換しようとするのですが、全くコロニーが取れません。1 pgほどをいつも形質転換に使っています。その後、100 ng-500 ngほどを形質転換に使うとようやく1コロニーほどを得られるといった感じです・・・おかしいですよね。。。 今、カナマイシンとゼオシンの両方でやり直しているので、それでうまくいけばいいのですが・・・ カナマイシンって使いにくい抗生剤なのでしょうか・・・。

(無題) 削除/引用 No.8453-9 - 2019/11/28 (木) 14:11:02 - mutagenesis ちきさん、 その方法は全く知りませんでした。 調べてみますね！ 今ではその方法にとって代わられてるとのことで、驚きです。

(無題) 削除/引用 No.8453-8 - 2019/11/28 (木) 11:34:53 - おお >Stratageneのプロトコルに従い、Dpn1処理した50ulの反応液のうち、1ulを形質転換に用いました。 電気泳動でどれくらい流したのか分かりませんが１０ｎｇとかぐらいは使っている感じですね。 Km OriがあるDNAがそれだけあってまったくバックグランドが出ないのは少し不思議です。PCR　ProductsなのでプラスミドよりTransformation効率は低いでしょうけど。大抵のConstructionには１０の７乗くらいのコンピテンシーがほしいところですが、お使いのものはどれくらいでしょうか？ ＞サーマルサイクルが終了後の電気泳動でモノが増えていることを確認できています。 PCRがうまく言ってないと申し上げたのはNickが入った環状DNAができて、その環状DNAから増幅するので環状DNAが増えるしくみになっているけど、うまく環状DNAが維持できずに平滑末端のDNAが出来上がってないかなど気がかりなところがあります。それが電気泳動で確認できますか？ 平滑末端が出来るようなプライマーにして、PCR　Productsをリン酸化（プライマーを先にリン酸化してもいいけど）、LigationしてTransformationするなら事がそこまで複雑にはならないのでそういうプライマーをデザインしなおすのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8453-7 - 2019/11/28 (木) 09:21:05 - ちき Stratagene (QuickChange?)ということは、2つのoligoをanealした時両側がblunt endsになるようにデザインするプロトコルでしょうか。私自身は最近はLiu and Naismithの改良版プロトコル(oligoを3'突出になるようにデザインする)しか使っていません。PCR効率が劇的に上がるので鋳型の持ち込みを考慮する必要がなく、DpnI digestionは通常必要ではありません。Takara PrimSTAR Mutagenesis Basal Kitが同じ原理を使っています。

(無題) 削除/引用 No.8453-6 - 2019/11/28 (木) 08:35:50 - mutagenesis みさん、Sakiさん、ありがとうございます。 変異導入実験だけでなく、同時並行でいくつものプラスミドの構築を行なっていますので、使用している大腸菌に関しては問題なくワークすることを確認しています。 Strategeneのプロトコルでは12-16サイクル程度までしか書かれていませんが、今回思い切って20まで上げてみましたが、それ以上に上げてみては？、ということでしょうか？やってみます...！

(無題) 削除/引用 No.8453-5 - 2019/11/28 (木) 08:26:23 - mutagenesis おおさま、ありがとうございます。 Strategeneのキットを使って変異を導入しています。 鋳型プラスミドはミディプレップから調製したもので新鮮です。 この鋳型を使って変異導入しました。サーマルサイクルが終了後の電気泳動でモノが増えていることを確認できています。 どのくらいの量をtrannsformしたかに関してですが、Stratageneのプロトコルに従い、Dpn1処理した50ulの反応液のうち、1ulを形質転換に用いました。 > まあいいですけど、できるなら前日に塗っておくと拡散されて表面だけ濃い状態は緩和できるでしょう。 昨日抗生剤入りのプレートを作製したので、もう一度トライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.8453-4 - 2019/11/28 (木) 07:42:34 - Saki コロニーが出ないのですね。 カナマイシンの量は問題ないと思います。私は100 mg/mLのストック溶液を10 uLを水で薄めて撒いています。 コントロール実験として １）DH5aコンピテントセル：鋳型プラスミドをトランスフォームして、細胞に問題がないことを確認してください。 ２）LigaseもしくはKinase：コンピテントセルに問題がなかったら、LigaseかKinaseがあやしいと思います。古そうだったら新しいのに変えるか、過去にうまくいった実験を再現してみるとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8453-3 - 2019/11/28 (木) 07:42:24 - み mutagenesis反応で作製したプラスミドが悪いのかtransformationの手技が悪いのかは大元のWild plasmidをポジコンに使用すれば区別できるでしょう。 あとはサPCRサイクル数増やすとか。

(無題) 削除/引用 No.8453-2 - 2019/11/28 (木) 05:45:21 - おお どの方法論でsite directed mutagenesisをやっているのかわかりませんがPCR Productsがあまり良くないのではないかと思います。バンド確認でわからない情報もあるかと思いますので、 結局どれくらいの量をTransformationしたのでしょうか？ ＞25mg/mlのストック溶液を作製し、その25ulを大腸菌LBプレートに塗りました。 まあいいですけど、できるなら前日に塗っておくと拡散されて表面だけ濃い状態は緩和できるでしょう。

site directed mutagenesisがうまくいきません。 削除/引用 No.8453-1 - 2019/11/28 (木) 01:44:35 - mutagenesis 質問させください。 site directed mutagenesisがうまくいきません。 私はThermoから購入したZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使って、PCR産物をライゲーションしました。目的のものが完成しました。次にこれを鋳型にして、site directed mutagenesisを行いました。 鋳型は1ngという少量を用い、site directed mutagenesisで少々多いですが20サイクル回し、アガロースゲル泳動できちんと増幅されていることを確認しました。 次にDpn1処理（1時間、37度）し、自作のDH5aに形質転換後（1時間の回復培養を経て）、カナマイシンにて選択を行いました。 site directed mutagenesisはちょこちょここれまでにしたことがあり、プライマーも専用のサイトを用いてデザインしているので間違ってはいませんし、きちんと増幅されていることも確認済みです。泳動時もオリジナルと同じバンドのパターンでした。 一つの懸念は、LBプレートです。 これまでLBプレートは抗生剤を含めず調製し、必要に応じてアンピシリンを直前に塗って使用していました。 カナマイシンは滅多に使わない抗生剤で、今回新しい粉末をGibcoから購入し、25mg/mlのストック溶液を作製し、その25ulを大腸菌LBプレートに塗りました。 この方法は抗生剤が圧倒的に多い量だとは思いますが、このフォーラムでもこの方法を教えていただき、特に今回のようにカナマイシンを使わねばならない時などは大変重宝しています。 次にやることとして、カナマイシン（20ug/ml）を含むLBプレートを調製して、そこに大腸菌を播種しようとは思っていますが、それ以外に大腸菌コロニーが出ないもしくはsite directed mutagenesisがうまくいかない理由としては何が考えられますでしょうか？ Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitのプラスミドを見ると、ゼオシンでも選択できるようなので、そちらも試してみようとは思ってはいます。 実験が進まずとても苦しいです。 間違っているところ、改善すべきところがありましたら、どうかご教示いただけませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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