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(無題) 削除/引用 No.845-5 - 2012/08/18 (土) 17:23:07 - AP バッファー関係の問題かな。 TBEのpHを測ってみましたか。pHペーパーで見るだけでもいいです。正しく作られていればたぶんpH 8くらいになっているはずです。ありがちなのが、Tris baseと間違えてTris HCl塩(Trizma HClなど）を使ったとか。EDTAはpH 8.0のストック溶液を使っているでしょうか。もし粉末から作るレシピだとしたら、2Na塩なのか3Na塩（あるいは4Na塩）なのかを間違うとまずいです。 サンプルは適正にバッファーされていますか。マーカーはバッファーされた状態でローディングダイと混合されているものでしょうか？　プラスミドの溶媒はなんでしょうか。ローディングダイ（ローディングバッファー）はバッファー成分を含まないので、水に溶けているDNAの場合、弱塩基性のバッファーを加える必要があります。バッファーが不十分だと弱酸であるDNAは電離が不十分になりチャージが減り、移動度が下がります。

(無題) 削除/引用 No.845-4 - 2012/08/18 (土) 15:34:50 - ◯ ゲル濃度が違うと、ダイの位置は変動しますが。。。 >マーカー（200-400ngを泳動）は寧ろ速く流れ過ぎている。BPBがゲルから流れ落ちそうな時点で既に10,12kbpのバンドがゲルの1/3以上流れており、小さいサイズのバンドは流れきってしまっている。但しマーカーの各バンドはサイズ通りに分離されている。 というところからすると、プラスミドのことを考慮しなければ、ラダーはまともな気がしますがいかがでしょうか？ 2種類のマーカーを入れて流し、異常がなければ、原因は確実にプラスミドではないでしょうか？ 温度の上がり過ぎのときは、経験的には、BPB等の色素もマーカーを含め全てのDNAのバンド自体も薄くなることが多い気がします。

(無題) 削除/引用 No.845-3 - 2012/08/18 (土) 15:03:12 - qq いくらのサイズのプラスミド（のはず）が、10kbp以上に異常なぼってりバンドとして検出されたのでしょう？ ゲノムじゃん？と、思ってしまいますが、いかがでしょう。 プラスミドをご自身で調製しましたか、それとも、市販のプラスミドをそのまま泳動するブルジョワでしょうか？ コンタミしたゲノムDNAであれば、制限酵素で長めに切れば、消えていきます。プラスミドをシングルカットする制限酵素で切ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.845-2 - 2012/08/18 (土) 14:46:54 - ~ 応急処置として、施設にあれば低温室で流してみては。 温度が原因で移動度がおかしくなることはあるようです。 または、定電圧で流してみては。 アガロースゲルということはサブマリンタイプの泳動漕ですよね。 通電面積のコントロールが難しい為、定電圧の方が再現性がよくなると思いますが。 または、1xTAEでゲル作製・泳動してみては。 バッファーが原因であれば結果が変わるかもしれません。 1%アガロースでBPBを流しきっているのですから、それほど小さなサイズのバンドが目当てなのではないのですよね。 あと、一応は電極がまっすぐになっているかを見てみてはいかがでしょうか。 白金線が曲がって電場が乱れ、泳動がおかしくなることもあるようです。

アガロースゲル電気泳動のトラブル 削除/引用 No.845-1 - 2012/08/18 (土) 14:13:13 - PAS DNAアガロースゲルの電気泳動で、不可解なトラブルに悩まされております。 泳動条件： 1%アガロースを0.5xTBEで作製し、60-90mAの定電流で泳動 問題点： １）プラスミド（100-400ngを泳動）がうまく流れず、ゲルには入るもののマーカーに対し10kbpよりも高い位置に留まっている。OC, CCC, linearなどは見られず太い塊のようなバンドが見られる。このバンドの下に、細い一本のバンドが見られる。 ２）これに対し、マーカー（200-400ngを泳動）は寧ろ速く流れ過ぎている。BPBがゲルから流れ落ちそうな時点で既に10,12kbpのバンドがゲルの1/3以上流れており、小さいサイズのバンドは流れきってしまっている。但しマーカーの各バンドはサイズ通りに分離されている。 これまでに、ストックの10xTBEバッファー、ゲルを作り直し（但し使用した粉は同じもの、ゲルの固さは妥当）、泳動槽、パワーサプライ、loading dyeを変えてみましたが、改善されません。異なるプラスミドやマーカーを流しても同様の現象が起こります。2,3日前までは問題ありませんでした。水は少なくともpHは問題ないですが、採水時の比抵抗は不明です。 マーカーとDNAの挙動が正反対なのは何故なのでしょうか。せめて何が原因か見当だけでもつけられれば良いのですが…。ご教授のほどお願い致します。

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