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返信 削除/引用 No.84-12 - 2012/02/03 (金) 22:08:05 - ino uenoさま コメントありがとうございます。 灌流固定はまだ行ったことはないのですが、凍結標本を使用した 通常の免疫染色の場合には一度試してみようと思っています。 今回は酸化ストレスを検出できるかということなので、 固定はダメみたいです。

(無題) 削除/引用 No.84-11 - 2012/02/03 (金) 15:17:40 - Ueno PFAで切片を後固定をするならば、 新鮮凍結切片にこだわる必要も無いので、 還流固定などを試してみてはいかがでしょうか。 有機溶媒による固定が必要な場合は、 新鮮凍結切片の後固定にならざるを得ませんが。

返信 削除/引用 No.84-10 - 2012/01/30 (月) 19:08:20 - ino bluehornet さま ありがとうございます。 -20℃だとシャーベットを削っているみたいでした。 少し暖めた状態でトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.84-9 - 2012/01/30 (月) 13:44:32 - bluehornet 私もマウスの肝臓の新鮮凍結切片を作成していたことがありますが、組織さんのおっしゃるとおり、温度は高めに設定して-16℃で行っていました。低いとinoさんの経験したとおりのボロボロ状態でしたよ。

(無題) 削除/引用 No.84-8 - 2012/01/26 (木) 17:54:19 - 組織 > OCTコンパウンドにスクロースを混ぜたりというのも聞いたことが > あるのですが、一般的に行われているのでしょうか？ このフォーラムでは何度か話題になってたかと思いますが、私はやったことないです。マウス肝臓はそれほど切りにくい臓器ではないので、コンパウンドそのままでも十分かと思います。

返信 削除/引用 No.84-7 - 2012/01/26 (木) 14:00:08 - ino 組織さま 回答ありがとうございます。 やはり温度は重要なのですね。 OCTコンパウンドにスクロースを混ぜたりというのも聞いたことが あるのですが、一般的に行われているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.84-6 - 2012/01/26 (木) 13:46:31 - 組織 症状からすると薄切時の問題のようですね。切片がすだれ状（で分かりますか？）になっていたら、温度が低すぎるのが原因でしょうね。-20度ならそこまで低くもありませんが。 肝臓なら-10から−15度くらい（ブロックが柔らかくなりすぎない程度）で切ってます。

返信 削除/引用 No.84-5 - 2012/01/26 (木) 12:05:30 - ino み　さま ご回答ありがとうございます。 他の組織は問題なく作製できる腕をお持ちでしょうか？ →以前練習で心臓、血管を薄切したことがありますが、ある程度の形態は 　保持されていました。まだまだ未熟でもありますが・・・・。 　やはり組織がしっかりしている臓器のほうが薄切しやすいということ 　でしょうか。パラフィンはうまく切れるようになったのですが、 　凍結肝臓には難渋しています。酸化ストレスの検出には4%PFAでの 　cryoprotectionはどうしても避けたいので・・・・。 肝臓のみの問題なら、温度・厚さを微妙に上げ下げするとか。 →次回は-20℃でなく-15℃くらいまで上げてみます。 厚さより、温度の方が重要だと思いますが。 低すぎるとシャキシャキとシャーベット状に切れて上手くいかないでしょう。 →まさにシャキシャキ状態です。

返信 削除/引用 No.84-4 - 2012/01/26 (木) 11:56:29 - ino 組織さま ご回答ありがとうございます。 目的は免疫染色でしょうか？ →免疫染色、酸化ストレスの検出をしたいと考えております。 まず、切片がボロボロという症状が、薄切時からあるのか、染色後にできるのかを確認して下さい。薄切後の未染色切片を鏡検すれば区別できます。 →切片がボロボロになっているのは薄切時からあります。 　パラフィンとは比較になりません。 �Eスライドガラスは接着剤コートしてあるものでしょうか？ 乾燥は30分以上いた方がいいでしょう。 →スライドはシランコートを使用しております。 　次回から乾燥は長めにしようと思います。 　未固定だと細胞が壊れてしまうかと思って短めにしていました。 �D目的次第ですが、10〜15umくらいが安定して切りやすいでしょう。 ちなみに「切り出し」は組織ブロック作製時のスライス操作を指し、正しくは「薄切」だと思います． →もう少し厚めに薄切するのがよさそうですね。 　「切り出し」の使い方を間違ってましたご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.84-3 - 2012/01/26 (木) 10:08:45 - み 他の組織は問題なく作製できる腕をお持ちでしょうか？ 肝臓のみの問題なら、温度・厚さを微妙に上げ下げするとか。 厚さより、温度の方が重要だと思いますが。 低すぎるとシャキシャキとシャーベット状に切れて上手くいかないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.84-2 - 2012/01/26 (木) 08:39:23 - 組織 目的は免疫染色でしょうか？ まず、切片がボロボロという症状が、薄切時からあるのか、染色後にできるのかを確認して下さい。薄切後の未染色切片を鏡検すれば区別できます。 以下、思いついたコメントです。 �Eスライドガラスは接着剤コートしてあるものでしょうか？ 乾燥は30分以上いた方がいいでしょう。 �D目的次第ですが、10〜15umくらいが安定して切りやすいでしょう。 ちなみに「切り出し」は組織ブロック作製時のスライス操作を指し、正しくは「薄切」だと思います．

マウス肝臓の新鮮凍結切片作成について 削除/引用 No.84-1 - 2012/01/25 (水) 21:55:15 - ino いつもお世話になっております。 マウス肝臓で新鮮凍結切片を作りたいのですが、どうしても組織がボロボロになってしまいます。確かに考えてみれば-20℃のレバ刺しを切っているみたいなものです。何かよい方法を知っている方はおりませんでしょうか？ 現在行っている方法は以下のとおりです、 �@切り出した肝臓をOCTコンパウンドに包埋 �Aドライアイスもしくは-80℃に入れる �B切り出す前に-30℃にいれ徐々に温度にならす �C-20℃のクライオスタットにいれる �D6μmから10μmで切り出し（もっと厚くてもよいのでしょうか？） �Eスライドに貼り付けて室温乾燥　5分 �F4%PFA, アセトン/メタノールで固定 ご教授いただければ幸いです。

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