Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

細胞内Ca濃度測定について トピック削除
No.8399-TOPIC - 2019/11/12 (火) 20:11:48 - agiu
Fluo 3-AMを用いて細胞内Ca濃度を測定しようと考えています。

最終的には薬物処置によるCa濃度の増減を検討したいのですが、
その前段階として、Fluo 3が細胞内のCa上昇に反応するのか確認するため、カルシウムイオノフォアであるA23187を処置して測定を行うことになりました。

推奨プロトコルにはFluo 3をロードしてからA23187を用いて平衡化するとあったのですが、どの程度の処置時間処置すればよいのか分からない状況です。
一度、他の情報を参考に37℃-20分で処置したのですが、上昇が確認できませんでした…

同じような検討をしたことのある方がいらっしゃいましたら、どのような条件で行われたのか、教えていただけると嬉しいです。
よろしくお願いいたします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.8399-8 - 2019/11/16 (土) 20:30:19 - 774R
私の経験でも蛍光強度の上昇は一過的ですね。
確証はないけど、穴開けでCa2+指示薬も漏れ出してるんじゃないかと疑っています。

(無題) 削除/引用
No.8399-7 - 2019/11/14 (木) 11:18:31 - agiu
たくさんのご意見ありがとうございます。

DOJINのプロトコル集に従い、Fluo-3を処置した後、3回ほどwashをしてからA23187を処置しております。
そちらのプロトコル集に、Fmaxを求めるためにカルシウムイオノフォアで平衡化させるとあったため、20 min程度処置しました。


ただみなさまがおっしゃるようにCaの上昇は非常に短時間で、すぐに減退してしまうという文献も目にしたため、平衡化なのか刺激なのかよくわからない状況です。

用いている測定器のスペックなど、再度確認してみたいと思います…

(無題) 削除/引用
No.8399-6 - 2019/11/13 (水) 15:47:50 - おお
横からになっちゃいますが、よく分からないですがA23187で穴を開けっ放しでもあがったままにならないのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.8399-5 - 2019/11/13 (水) 10:53:57 - AA
顕微鏡のスペックは大丈夫でしょうか？
み さんもコメントされていますが、Ca応答は非常に早い反応で、
感度が弱くて露光に時間を使うような顕微鏡だと捉えることができません

(無題) 削除/引用
No.8399-4 - 2019/11/13 (水) 09:30:03 - qq
Fluo3AMをロードした後、培地を交換していないとか、ないでしょうか？
メーカー（例えばドージン）のweb-pageに使用例が載っているので、参考になるかもしれない。
acetoxymethylエステルを加水分解する酵素が無い特別な細胞という可能性が絶対ないとは言い切れないが、普通そんなことはないでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.8399-3 - 2019/11/13 (水) 09:11:50 - おお
https://www.researchgate.net/publication/277963583_Potential_Interactions_of_Calcium-Sensitive_Reagents_with_Zinc_Ion_in_Different_Cultured_Cells

https://www.researchgate.net/figure/Effect-of-exposure-to-calcium-ionophore-A23187-on-cytosolic-Ca-2-levels-in-NK-cells_fig4_24276853

(無題) 削除/引用
No.8399-2 - 2019/11/12 (火) 20:26:53 - み
>[Re:1] agiuさんは書きました :

> 推奨プロトコルにはFluo 3をロードしてからA23187を用いて平衡化するとあったのですが、どの程度の処置時間処置すればよいのか分からない状況です。
> 一度、他の情報を参考に37℃-20分で処置したのですが、上昇が確認できませんでした…


A23187で平衡化とはどういうことでしょうか？解釈間違っていませんか？
Fluo3含有培地で30分くらい培養後、１回リンスして通常培地に戻し、A23187で刺激するのでは。
しかも蛍光の上昇は２，３秒以内がピークで２０−３０秒も経つと定常レベルに下がるくらい速い反応だと思うけど、速い反応を検出する機器は所有されていますか？

細胞内Ca濃度測定について 削除/引用
No.8399-1 - 2019/11/12 (火) 20:11:48 - agiu
Fluo 3-AMを用いて細胞内Ca濃度を測定しようと考えています。

最終的には薬物処置によるCa濃度の増減を検討したいのですが、
その前段階として、Fluo 3が細胞内のCa上昇に反応するのか確認するため、カルシウムイオノフォアであるA23187を処置して測定を行うことになりました。

推奨プロトコルにはFluo 3をロードしてからA23187を用いて平衡化するとあったのですが、どの程度の処置時間処置すればよいのか分からない状況です。
一度、他の情報を参考に37℃-20分で処置したのですが、上昇が確認できませんでした…

同じような検討をしたことのある方がいらっしゃいましたら、どのような条件で行われたのか、教えていただけると嬉しいです。
よろしくお願いいたします。
全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。