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(無題) 削除/引用 No.8395-6 - 2019/11/14 (木) 02:32:32 - おお 確かにIntegrationの可能性はありますね。 ちなみにルシフェラーゼアッセイに使われるConstructでマルチクローニングサイトのすぐ手前にPolyA signalをおいているものがあります。上流からのTranscriptionのバックグランドを抑えるためだそうです。AmpのあたりからTranscriptionがどうも始まっているという話を聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.8395-5 - 2019/11/13 (水) 11:54:29 - asan ちなみに、同様のことがCas9のplasmidにも言えるので、厳密にはこっちも確認したほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.8395-4 - 2019/11/13 (水) 11:53:23 - asan 単純にランダムインテグレーションでどこかの遺伝子のプロモーター付近に挿入されたトランスクリプトがでてきてる細胞をセレクションしてるに過ぎないと思いますけどねー。 293とか結構な割合でインテグレートしますよ。特にpuroとかの抗生物質でセレクションかけると。

(無題) 削除/引用 No.8395-3 - 2019/11/12 (火) 10:01:04 - moz 検討したことすらありませんので想像ですが、実用上はPCR産物が逆向きにクローン化されたplasmid使ってみたらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8395-2 - 2019/11/12 (火) 09:56:08 - おお 一つ言えることは絶対はないです。 例えばルシフェラーゼのリポータープラスミドですがプラスミドのいろいろな場所に（アンプとか、大腸菌で機能する配列などをふくめ）ヒトなどの細胞でEnhancerが結合するだろうというところがあり、プロメガはそういう場所の塩基配列を改変してそういうことがないようにした商品を出しています。

TA plasmidからタンパク質は絶対に発現しないでしょうか？？ 削除/引用 No.8395-1 - 2019/11/12 (火) 08:34:41 - かえで Zero Blunt™ TOPO™ PCR Cloning Kitを用いてPCRタンパク質（ある遺伝子のC末プラス、HAx３タグ）をクロー二ングしました。 thermofisher.com/order/catalog/product/450245#/450245 このPCR産物はクリスパーキャス9による遺伝子挿入用の鋳型DNAとして293細胞へコトランスフェクションします。私の理解では、このTOPOプラスミドでは哺乳類動物で働くプロモータが無いため、293Tでは鋳型DNAが直接翻訳されるのでは無く、あくまでエンドの遺伝子と融合した形で発現すると考えていました。 ところが、この鋳型のみのトランスフェクトだけでもC末+HAx3という断片だけが発現していることがわかりました。クリスパーキャス9プラスミドが無ければ、これらは発現すらせず、クリスパーキャス9プラスミド共トランスフェクションでのみ100kD付近にHAx3タグタンパク質が検出されると考えていました。 なぜこのようなこと（つまりTOPOベクターにクローニングしたPCR産物が翻訳されている）が起きたのか理解できていません。このようなご経験はありますでしょうか？

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