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(無題) 削除/引用 No.8391-9 - 2019/11/12 (火) 14:38:04 - moz > (1)何個程度の遺伝子を想定しているのでしょうか？ > 300〜400個 > (2)(4)をひとつずつ実施することに大変さを感じていまして (2)予算に余裕があるなら全合成を外部委託。数量割引きが有るはずなので標準価格の半額程度になると思う。国外を含め数社から見積もりを取ると良い。経験上国外メーカーが安価。どうせならコドン最適化すると良いだろう。 クローン化後配列確認が必要ですがDNA断片作成ならさらに安価です。 これを鋳型に96well formatでPCRでPromoter-合成DNA断片-タグ-WPRE-polyA領域を作成し、96well formatで精製して遺伝子導入に供する。 精製時、過飽和でアプライすると収量はほぼ一定になるので、個別の定量は不要になるかも。 なお、全長増幅用のPrimerはNuclease耐性を少しでも持たせるために5’端2塩基ほどS化しても良いかも。 DNA配列異常による出来損ないタンパクも混入するとは思いますが、First Screeningでは良しとする。 最終スクリーニング（確認実験）ではクローン化して配列確認したplasmidを使う。 クローン化するなら、外れ（インサート無し）クローンがほとんどない自殺遺伝子が入ったベクターを使うべきで一方向性にクローン化するように工夫する。市販なら一方向性TOPOクローニング用発現ベクターかな。96well フォーマットで10ug程度のplasmidの精製は可能。シリカなら、アルコール洗浄の前に4M guanidine hydrochloride/40%isopropanolでの洗浄を加えるとエンドトキシンの混入がかなり減るらしい。実際CHOや293細胞なら大きな問題はなかった。 (4)精製には、培地から1ステップで96well formatでの精製も容易なSBPタグ付加が良いと思う。分泌タンパクならC末に付加かな。。 また、どのようなアッセイ法をお考えか不明ですが、SNAPタグ等でplate(well)底面に分泌タンパクを固相化（精製不要）して細胞をふりかけ刺激するなんてことも可能かも。または磁性ビーズに捕捉してビーズごと細胞にふりかけるとか。

(無題) 削除/引用 No.8391-8 - 2019/11/12 (火) 12:54:23 - プロテイン おお様、moz様 ご意見ありがとうございます。 まずご指摘いただいた部分の回答をします。 (1)何個程度の遺伝子を想定しているのでしょうか？ 300〜400個 (2)(4)をひとつずつ実施することに大変さを感じていまして、ここを簡略化または他の手法で置き換えられないかと思った次第です。 (3)(5)この部分はさほど大変さを感じておりません。 アウトプットとしては培養上清が得られればいいです。 100個だと個別の方が早いですね。。 だとしたら迂回方法など探さずに素直に実験した方がいいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.8391-7 - 2019/11/12 (火) 09:51:03 - moz すいません。議論がまとまっていませんね。 (1)何個程度の遺伝子を想定しているのでしょうか？ (2)それらの遺伝子のクローニング＞ベクターへの組込＞精製が、面倒なのでしょうか。 (3)それらの遺伝子の個別の遺伝子導入が面倒なのでしょうか。 (4)それらの遺伝子産物（分泌タンパク）の精製が面倒なのでしょうか。 (5)それらの遺伝子産物（分泌タンパク）の評価が面倒なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8391-6 - 2019/11/12 (火) 08:45:35 - moz ＞遺伝子ひとつずつで実施するのは煩雑なため 何個程度を想定しているのでしょうか？ 最終評価でなにをしたいか不明なのですが、最終アウトプットまで考慮して戦略を立てる必要があります。 評価法の簡便さ・頑強さ（ブレが少ない）の方が重要な気がします。 100個なら個別の方が早いと思います。千個だと（一応）上手い方法を必死に考えますね。 ＞ひとつのベクター内に複数候補を一度に組み込んで分泌させてしまう方法 これはおおさんの指摘にもあるように複数のplasmidのco-transfectionでも同様の結果が得られるでしょう。後で候補を分けることを考えるとplasmidが個別の方が二度手間がない。 予算に余裕があるならクローニングなんて千個くらい外部委託！というのも今時ですし、たかが千個という考えもあります。 2~3次元マトリクスで組み合わせを考えると候補が早く見つかりそうです。

(無題) 削除/引用 No.8391-5 - 2019/11/12 (火) 01:32:55 - おお アッセイ系の細胞に直接トランスフェクションしたり、分泌しやすい細胞にトランスフェクションしてCoculture（細胞同士が直接コンタクトしないような系も組める）するのはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.8391-4 - 2019/11/11 (月) 21:07:38 - プロテイン moz様 ご回答ありがとうございます。 量は最初はスモールスケール（〜10ug）で考えています。仰る通り、はじめは精製せずに上清だけでも構いません。 背景としては、これまでは発現ベクター構築〜強制発現という流れでやってきたのですが、遺伝子ひとつずつで実施するのは煩雑なため、もっと工夫したやり方がないかご助言いただきたかったのです。

(無題) 削除/引用 No.8391-2 - 2019/11/11 (月) 16:29:04 - moz 必要なスケールや詳細が分からないから、根幹の実験アイディアを他力本願で頼る質問？にも答えようがないけど...。各分泌タンパクについて、どの程度の量・精製度が必要ですか？ 精製が必要な理由は何ですか？培養上清そのもので不都合な理由は？ タグを付加しても大丈夫か否か？ タンパク各10ug程度の収量で良ければ、 発現ベクターは、発現ユニットのPCR産物でも代用できる（＝簡単なシリカカラム精製でOK)し、自殺遺伝子を組み込んだベクターを使えばクローニングしなくても良い（かもしれない）。 96wellフォーマットのシリカカラムでも10ug程度ならplasmidは精製可能、イオン交換カラムなら30ug程度は取れる（ただしEtOH沈殿が必要） この程度なら6-12well dish等で遺伝子導入可能(培地量1~4ml)。 精製に関しては、SBPタグ（＋StAv-磁性ビーズまたは96wellフォーマットのメンブレン）を使えば一回でかなりの精製度が得られる。ただしプラスチック壁面への吸着への注意は必要（成長因子は吸着しやすいものも多い）。もっと収量が多くする工夫はありそう（あっても言わないかも〜）。

分泌タンパク質の合成 削除/引用 No.8391-1 - 2019/11/11 (月) 15:38:41 - プロテイン 現在、複数の分泌タンパクを使い、その機能解析の計画をしています。 そこで分泌タンパクの作製についてご質問させてください。 これまでは発現ベクターを用いてひとつずつ合成・分泌・精製という流れで考えていたのですが、候補が多く、ひとつずつ作業するのはかなりのマンパワーを要します。このような理由から組換えタンパクの購入においても高額となってしまいます。 そこで複数の分泌タンパクを合成したい場合に何か良い技術をご存知ないでしょうか？たとえば網羅的にタンパクを合成する手法や、ひとつのベクター内に複数候補を一度に組み込んで分泌させてしまう方法など。 私の考えている方法以外にも対応があれば検討したいと考えております。 よろしくお願いします。

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