Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

相同組換えで遺伝子破壊（ダブルクロスオーバーの場合） トピック削除
No.839-TOPIC - 2012/08/15 (水) 22:35:53 - 初心者
標的遺伝子の5‘領域+抗生物質耐性遺伝子等のマーカー+標的遺伝子の3‘領域　をクローニングしたプラスミドベクターを用いて、宿主細胞（菌）に形質転換し、ダブルクロスオーバーリコンビネーションで遺伝子破壊をします。
形質転換を行う際、このプラスミドベクターは以下のどれにして使うのが好ましいでしょうか。または、皆様が試された方法と形質転換効率などをご教授下さい。
①環状のまま使う
②制限酵素処理して二つのフラグメントに切断して、そのまま使う
③制限酵素処理して二つのフラグメントにし、さらにフラグメントアイソレーションで、標的遺伝子の5‘領域－抗生物質耐性遺伝子等のマーカー―標的遺伝子の3‘領域が含まれるフラグメントのみを使う
④制限酵素処理で1部位のみ切断し、リニアの状態にして使う

僕の周りでは、④、②、③、①の順で、やっている人が多いです。
初心者なので勉強中ですが、僕は③が一番良いと考えています。
①でやっているという先輩もいますが、①でもダブルクロスオーバーの組換えはうまくおこるのでしょうか？環状のまま使うのは、キャンベル型のシングルクロスオーバー組換えでプラスミドベクターの全ての配列を組み込む時しか使えないと思っていました。
②か④でも大丈夫な気がしますが、③のように標的配列＋マーカーだけのフラグメントにした方が、余計なものが存在しない分、効率が増すのではないかと、僕自身は思っています。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 ～ 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.839-5 - 2012/08/19 (日) 10:37:43 - 中年
AP様がお書きになっているようにDNAの断端がrecombinogenicなので、②か③ということになりますが、酵母の場合ならば②で行う方が多いと思います。形質転換に際してはどのみちキャリアのDNAを沢山入れるので、ベクター側の断片が問題になるとは思われません。

酵母と 削除/引用
No.839-4 - 2012/08/17 (金) 23:01:23 - 初心者
中年様、AP様、ありがとうございます。
生物種を記載せず失礼しました。
AP様、生物種に関係ない大原則、とても有難いです。教えて頂いたことを基にテキストや実験書を読み進めたいと思います。
微生物全般を扱うラボにおりますが、分子遺伝学的なことに詳しい方がいません。原理が分からずとも「やれば何とかうまくいくから」というスタンスの先輩ばかりなので、ほぼ独学で原理や分子生物学の基礎を勉強中です。こちらでご意見ご教授頂けるのは非常に有難いです。

(無題) 削除/引用
No.839-3 - 2012/08/17 (金) 18:04:33 - AP
生物種による問題もあるだろうし、おそらくあなたの説明で話が通じるのは、かなり近い同業者で経験豊富な人間だけのようにおもうのですが（すくなくとも私にはちんぷんかんぷんです）。

ひとつ、生物種に関係ない大原則をいいますと、相同組換えによる遺伝子ターゲティングというのは、生物の持つ相同組換え修復の機構が作用することによります。相同組換え修復は、細胞内で通常存在しないはずの、二重鎖切断（DSB)によって惹起され、切断をもつ鎖の相同配列を鋳型として利用することによって切断点から鎖を伸ばすように作用します。どの範囲までを相同配列からつくり直すかによって、遺伝子全部が入れ替わることもあるだろうし、両鎖のキメラ（例えば前半と後半の由来が異なる）こともあるでしょう。

減数分裂で起こる染色体の交叉というのも、ある酵素(TopoII)が染色体DNAに生じさせた二重鎖切断を修復する過程で生じると見ることもできます。

要は、ターゲティングといえども生物がもともと持っている機構を利用しているのであって、レパートリーにない反応は起こらないのです。

で話を戻すと、相同組換えにはDSBが必要なので、環状は不適、それでもターゲティングが起こることがあるのは、内在性のヌクレアーゼでDSBが生じるためというのが、コンセンサスではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.839-2 - 2012/08/15 (水) 23:08:36 - 中年
どの生物種の話でしょうか？

相同組換えで遺伝子破壊（ダブルクロスオーバーの場合） 削除/引用
No.839-1 - 2012/08/15 (水) 22:35:53 - 初心者
標的遺伝子の5‘領域+抗生物質耐性遺伝子等のマーカー+標的遺伝子の3‘領域　をクローニングしたプラスミドベクターを用いて、宿主細胞（菌）に形質転換し、ダブルクロスオーバーリコンビネーションで遺伝子破壊をします。
形質転換を行う際、このプラスミドベクターは以下のどれにして使うのが好ましいでしょうか。または、皆様が試された方法と形質転換効率などをご教授下さい。
①環状のまま使う
②制限酵素処理して二つのフラグメントに切断して、そのまま使う
③制限酵素処理して二つのフラグメントにし、さらにフラグメントアイソレーションで、標的遺伝子の5‘領域－抗生物質耐性遺伝子等のマーカー―標的遺伝子の3‘領域が含まれるフラグメントのみを使う
④制限酵素処理で1部位のみ切断し、リニアの状態にして使う

僕の周りでは、④、②、③、①の順で、やっている人が多いです。
初心者なので勉強中ですが、僕は③が一番良いと考えています。
①でやっているという先輩もいますが、①でもダブルクロスオーバーの組換えはうまくおこるのでしょうか？環状のまま使うのは、キャンベル型のシングルクロスオーバー組換えでプラスミドベクターの全ての配列を組み込む時しか使えないと思っていました。
②か④でも大丈夫な気がしますが、③のように標的配列＋マーカーだけのフラグメントにした方が、余計なものが存在しない分、効率が増すのではないかと、僕自身は思っています。
全5件 ( 1 ～ 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。