全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.8389-11 - 2019/11/12 (火) 02:05:41 - おお あとは支持体を変えるというのも試せることかな。 合成ポリマーとか磁気ビーズとかでGSTビーズはなかったっけ。

(無題) 削除/引用 No.8389-10 - 2019/11/12 (火) 01:26:43 - おお Detergentをいくらか試してもいいかと思いましたが、、、

(無題) 削除/引用 No.8389-9 - 2019/11/12 (火) 01:03:37 - 遼 返信遅れましてすみませんでした。 あのさん 大腸菌以外の選択肢はお恥ずかしながら盲点でした。 今回は難しそうですが、今後のために勉強しておきたいと思います。 APさん 先述の通りGSTタグ単体では溶出できますが（つまり、実験手技の問題ではなさそう）、タグ切断後のタンパク質は全く溶出されません。 また、GST融合タンパク質は半分弱しか溶出できていなく、結局はアグっているのかなと考えております。 もうどうしようもないため、現在、融合タンパク質のまま実験をすることを考えています。 SYBR masterさん 教えていただいた論文を読んで、勉強させていただきます。 皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8389-8 - 2019/11/11 (月) 11:05:03 - SYBR master NDSB(Non-Detergent SulfoBetaine)シリーズとかTrehaloseをカラムに吸着、Prescission Protease切断、および溶出時に入れておく方法があります。 NDSB TrehaloseでGoogle Scholarで2012年以降で検索してみてください。 PlosOneの2012,2014,2016の論文が参考になると思います。 NDSBはメルクからパンフレット出ています。web siteからダウンロード可能です。 セファロースへの非特異吸着は、どの時点で起きているのかは、個々のタンパク質で異なると思いますので、カラム吸着の時点から入れておく方が良いかもしれないです。 ただ、どれが良い添加剤であるかどうかは、個々のタンパク質で異なると思いますので、片っ端に試してみるしかないです。

(無題) 削除/引用 No.8389-7 - 2019/11/11 (月) 10:28:12 - あの >と言われていますので、GSTを切出さなくてもすでに不溶化している可能性は高いと思います。 ごめんなさい。私の勘違いですね。

(無題) 削除/引用 No.8389-6 - 2019/11/11 (月) 10:21:23 - あの APさん、 トピ主の方は プロトコル通りのElution Bufferを使っても、溶出してきません。 と言われていますので、GSTを切出さなくてもすでに不溶化している可能性は高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.8389-5 - 2019/11/11 (月) 10:17:04 - AP タグを切り離したとたん不溶化するタンパク質はある。 特にGSTはサイズも大きめ、親水性も高いので融合させると不溶性のタンパク質でも可溶性になることが多い（それを期待してタグに選ばれるくらい）。 たぶん、タグを切り離さなければ普通に溶出できて、溶出液中でタグの切断をすると目的のタンパク質が不溶化して凝集するのが見えると思う（沈殿を集めれば純度の高いものが得られるわけだが）。 結局、カラムから溶出できないのが問題ではなく、目的のタンパク質が通常の条件では不溶性であり、Nativeかつ可溶性にすることが困難というところが問題になるんじゃないでしょうか。 GTSタグはどうしても外さないとならないのかな？　可溶性に残すためにあえて付けっぱなしにすることもあると思うけど。

(無題) 削除/引用 No.8389-4 - 2019/11/11 (月) 10:00:53 - あの 私の場合と全く同じですね。 IPTGの濃度や誘導温度、時間、更には培地をM9にしたりautoinduction mediaにするか、finc zinger proteinなら培地にZnを加えているか、他にもたくさん最適化のファクターは存在します。 もし大腸菌に拘る理由がなければ、COS7をお勧めします。 哺乳動物での発現系は大腸菌に比べ圧倒的に劣ると思っていましたが、モノにもよるんでしょうか、私は10 cm dish 10枚のCOS7から1 mg弱目的のタンパク質を無血清培地中から精製しました。 見切りをつけることも大事かと思います。

(無題) 削除/引用 No.8389-3 - 2019/11/11 (月) 09:53:14 - 遼 あのさん ご意見ありがとうございます。 Prescission Protease処理後はCleavage Buffer(Tris-HCl,NaCl,EDTA)で溶出しています。 切断後、ビーズに結合したままのGSTタグはグルタチオンで溶出し、pHは8.0に調整しています。 GSTタグ単体の溶出はしっかりとされます。 自分も条件を色々と変えてはいるのですが、目的タンパク質があると何故か溶出されないのです…。

(無題) 削除/引用 No.8389-2 - 2019/11/11 (月) 03:06:07 - あの >プロトコル通りのElution Bufferを使っても、溶出してきません 還元型グルタチオン溶液を使われたということですか？ pHは調整されましたか？ 私も経験があります。 グルタチオン濃度をあげたり、時間を長くしたり、オクチルグルタチオンを使ったりもしましたが全く溶出でいませんでした。同様にon beadsではトロンビンで切断されていました。 おそらく、ビーズ上で局所的に高濃度になり、アグっているのだと思います。 私は結局打開することができず、哺乳動物（COS7）での分泌発現系に切り替えました。

セファロースからの溶出 削除/引用 No.8389-1 - 2019/11/11 (月) 02:56:30 - 遼 とあるタンパク質をpGEXベクターでGST融合タンパクとして発現させました。 カラムにglutathione sepharoseを充填して大腸菌破砕後の上清を流し、ビーズに結合させます。その後Prescission Proteaseで切断すると、このタンパク質はしっかり切断されるのですが(ビーズを加熱処理したサンプルの電気泳動により確認)、プロトコル通りのElution Bufferを使っても、溶出してきません。 どなたか、ビーズからタンパク質を溶出する過程で苦戦された方はいらっしゃいませんか？ また、その時どのように対処されましたか？ Nativeなタンパク質が欲しいです。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---