24ウェルプレートで癌のセルラインにおける至適ピューロマイシン濃度を決めました。
上は8 ug/mlから下は0.125 ug/mlまで。4日をエンドポイントとし、じっくり確実に死ぬ濃度は1 ug/mlでした。
そこで本番では、100cmディッシュに細胞を撒き、8割くらいのコンフレンシーでプラスミドをトランスフェクト（Fugene6）し、3日目にピューロを加えました。3日目に加えた理由は、AAVS1領域にピューロマイシン抵抗性遺伝子をノックインにて挿入したかったためです。
トランスフェクション時の細胞死は一切見られず、3日のうちに細胞は100％コンフレンシーを超えてしまいましたが、パッセージすることなく、ピューロを加えたところ、一晩経ってディッシュを見るとほぼ6割ほどが死滅しており、さらに1日経つと9割以上が死滅していました。
ノックイン効率はせいぜい1％未満だとは思いますが、それにしても1ug/mlという濃度はさきの条件検討では4日かけてじっくり死滅する濃度のはずでした。8ug/mlでは今回同様非常に早く細胞は死滅しました。
そこでみなさんにお聞きしたいのは、
細胞のコンフレンシーが100％を超えてしまっているのが原因として考えられますでしょうか？
つまりノックインが無事なされたクローンも死んでしまっているのではと考えていて、次行う際にはパッセージはしようと思ってはいます... |
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