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(無題) 削除/引用 No.8383-7 - 2019/11/08 (金) 15:16:58 - あいみょん His tagの位置で吸着の仕方が大きく変わることはもちろんある。 ただ無理な時はもちろん無理です。後、Niが無理ならCoもきついかなーって思います。そもそもHistagが働いていないかも。 尿素等で変性させてからIMACを行うのはHis tagがあるのならば 機能するはずです。ただし、タンパク質の巻き戻し作業は難しく、 その作業で難航する可能性は考えておくべきです。 Hisの有無は、Histag認識の抗体でもつかってWBし、有無は確認してみたらどうでしょうか？簡易的です。 またIMACにこだわらず、陰イオン等クロマトグラフィーでごりごり精製していくのも1つの手です。精製の手間はWEEK単位でかかってしまう可能性はありますが。

(無題) 削除/引用 No.8383-6 - 2019/11/07 (木) 18:21:11 - ひすこ コメントありがとうございます。 >[Re:5] おおさんは書きました : > 溶出したのが１０％で後はカラム内でアグッているという可能性は否定してからの考察でしょうか？ 少なくとも原液とフロースルーのフラクションで目的タンパク室がほとんど同じくらい検出されてしまったので、からむにタンパク質がくっついてないと思っております。 >[Re:4] おおさんは書きました : > 結合させるときにノンすぺを少なくするために若干のいみだぞーるを入れる事があるが、もし入れているならその量を減らしてみてもいいかもしれない。 > > 共雑物で邪魔しているものがあるなら薄めてからのせるのもでだし。 > > バッファーもいくらか工夫できるとおもう。 タンパク質溶液は１０ｍM のイミダゾール存在下でカラムに結合させております。たしかにイミダゾールをなくしてもいいかもですね。 > Co-NTAビーズは使った事がないでど多少結合力が弱いのでのんすぺが減らせるんじゃなかったっけ？ >[Re:3] mozさんは書きました : > Co-NTAビーズは特異性は高い（精製度が上がる）けど収量が少ない経験が多い〜ほとんどです。 Co-NTAにしても精製量が増えることはなさそうですね。 >[Re:2] みさんは書きました : > 限定分解などでタグが切断されている可能性も考えられなくはない > たしかにHisタグがちゃんとあるかどうかは検討してないですね。 とりあえず、タグのつけ方や位置を変えるのが一番解決になりそうな気がしました。

(無題) 削除/引用 No.8383-5 - 2019/11/07 (木) 17:46:25 - おお 溶出したのが１０％で後はカラム内でアグッているという可能性は否定してからの考察でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8383-4 - 2019/11/07 (木) 17:29:36 - おお 結合させるときにノンすぺを少なくするために若干のいみだぞーるを入れる事があるが、もし入れているならその量を減らしてみてもいいかもしれない。 共雑物で邪魔しているものがあるなら薄めてからのせるのもでだし。 バッファーもいくらか工夫できるとおもう。 手短にできる条件検討はやってみながらＴａｇのいれかたのデザインも再検討していけばいいのでは。 Co-NTAビーズは使った事がないでど多少結合力が弱いのでのんすぺが減らせるんじゃなかったっけ？

(無題) 削除/引用 No.8383-3 - 2019/11/07 (木) 17:24:44 - moz Co-NTAビーズは特異性は高い（精製度が上がる）けど収量が少ない経験が多い〜ほとんどです。

(無題) 削除/引用 No.8383-2 - 2019/11/07 (木) 16:41:52 - み 限定分解などでタグが切断されている可能性も考えられなくはない His-tag精製ならグアノジンやウレア変性状態でも結合可能だから立体構造による結合能の消失を疑うなら検討してもよい

Hisタグタンパク質がNi-NTAビーズにくっつかない 削除/引用 No.8383-1 - 2019/11/07 (木) 16:36:12 - ひすこ Hisタグタンパク質の精製を行っております。 複数のタンパク質に6xHisタグをつけて、タンパク質精製を行っております。 あるタンパク質Aは効率的に、Ni-NTAビーズにほぼ結合して、精製できるのですが、同時にタンパク質合成と精製を行った別のタンパク質Bは１０分の一ほどしかカラムに結合せず、ほとんどフロースルーのフラクションにいってしまいました。 両方ともC末にHisタグをつけています。発現量は両者とも同じくらいありました。 これはBのC末のHisがタンパク質に埋もれるなのどしてしまったと考えるべきでしょうか？ もしそうであれば、リンカーを伸ばすとか、N末にするとかで解決するでしょうか？ もしくはCo-NTAビーズにするとよくなったりしますか？ ご経験あるかた、ご教授ください。

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