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(無題) 削除/引用 No.8382-9 - 2019/11/08 (金) 07:44:55 - おお >まさにAPさんの予想通りで、コロニーリフトで >スクリーニングがうまくいかなかったため、 >別の手を考えているところです。 その程度ならそんなにあれこれ悩む話でもないでしょう。 大腸菌が発現誘導などでLysogenが誘導されないものだとLysozymeを加える。 DNAも出てくると思うのでDNaseを加える。出ないような工夫もあると思うけど（たとえば低塩濃度とか、マグネシウムてんか）あまりそういう細かいことをやったことがないので他の経験ある方があれば嬉しいかと。 変性作用が弱い（場合によってはELSAのときの希釈などで変性作用が現れなくなる）界面活性剤をつかう。 １００mM Tris HCl pH8 ２５０mM NaCl １mM MgCl２ １％ Triton X100 ０．５％ sodium deoxycholate ０．５mg/ml Lysozyme （Lysogenが誘導されるものでは必要なし） 10 ug/mL DNaseI ＋Protease inhibitors LysozymeはEDTA存在化で活性がMaxと言われているのでLysozyme処理してからMgCl2とDNase（EDTAにより阻害される）を加えるプロトコールもあるが、EDTAがないとLysozymeが全く効かないわけでもない。０．５％ sodium deoxycholateは不溶化してしまっている場合Tritonだけでは物足りないので加えてあるが、Tritonで完全に不溶化したものが抽出できなくてもELISAの抗体の検出力が悪くない限り検出できるとはおもう。実際にTriton単独で殆どが不溶化したままであっても上清をWBすると検出できるケースがほとんどだと思う。 ＞コロニーリフトで ＞スクリーニングがうまくいかなかったため、 単にポジがなかっただけということは、、、ELISAよりしっかり出そうな気がするけど、、、まあWBでつかえなくってELISAで使える抗体もあるけど。

大腸菌の可溶化用試薬 削除/引用 No.8382-8 - 2019/11/07 (木) 21:47:15 - ape おお さん、APさん、mozさん ご回答ありがとうございます。 余り時間が無いのですが、検討してみます。 まさにAPさんの予想通りで、コロニーリフトで スクリーニングがうまくいかなかったため、 別の手を考えているところです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8382-7 - 2019/11/07 (木) 18:46:56 - AP >大腸菌で発現させた組換えタンパク質のスクリーニングのために >大腸菌の可溶化物を直接ELISAに使用したいと考えています。 細部の実験デザインはわからないけれど、やろうとしているのは、昔よくやったライブラリーの発現スクリーニングみたいだなあ。 ファージ、あるいはプラスミドライブラリーをプレートにまいて、メンブレンでプラーク／コロニーリフト、これを抗体でプロービングしてポジティブクローンを見つけ出す。 陽性陰性の判断だけならこれで十分。 ELISAでやるのはシグナル強度も定量的に見る必要があるためかな？ スループットならコロニーリフトみたいな方法の方が優ると思うが。

(無題) 削除/引用 No.8382-6 - 2019/11/07 (木) 17:28:36 - moz Sigma-AldrichのCelLytic B の組成は以下らしいです（Netで拾った）。 1% (w/v) octyl-β-D-thioglucopyranoside 40 mM Tris HCl(pH 8.0)

(無題) 削除/引用 No.8382-5 - 2019/11/07 (木) 17:22:13 - おお APさんがおっしゃるように大腸菌からのリコンビナント蛋白の抽出はキットがある前から方法論が確立しているので、成分が分からないことによりどんな強み、弱点があるのかも見当つかないみたいなものより、自分の実験にあった試薬調製をしたほうがやりくりしやすいでしょう。 可溶化といっても発現確認が出来るようにほとんどの蛋白が抽出される事を考えているのか、大腸菌ないでアグッってないものを中心に溶出したいのかでも変わってくるし、あなたに合わせた組成は簡単に提示できないけど、リコンビナントを作成して実験で使ったような論文では大抵ちゃんとバッファーぐらいは明記してるし。

(無題) 削除/引用 No.8382-4 - 2019/11/07 (木) 16:52:54 - AP 市販の溶菌試薬なんてなかったころは、実験書等に従ってLysozymeと1%程度のNP-40とかTritonX-100なんかでやってたものさね。 組成比公開の各社溶菌試薬がどれほど優秀なのかはしらんけど、そういうの使わないと出来ない実験なんでしょうかね？

大腸菌の可溶化用試薬 削除/引用 No.8382-3 - 2019/11/07 (木) 16:30:23 - ape おお　さん ご回答ありがとうございます。 PopcultureもFastbreakも組成が明らかに なっているのでしょうか？特許等も 探ったのですが確実にこうだ、というものを 探し当てられませんでした。 知識が無く申し訳ありません。ご教授いただければ 幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.8382-2 - 2019/11/07 (木) 16:12:15 - おお ご自身で調製すればどんな試薬か把握できてるし安いと思うのだが、、、

大腸菌の可溶化用試薬 削除/引用 No.8382-1 - 2019/11/07 (木) 14:56:50 - ape いつも勉強させていただいております。 大腸菌で発現させた組換えタンパク質のスクリーニングのために 大腸菌の可溶化物を直接ELISAに使用したいと考えています。 数が多いので超音波破砕は現実的では無く、可溶化用の市販の 試薬を使用しようかと思っています。 候補として Popculture(NOVAGEN) Fastbreak(Promega) の2商品を考えていますが、Popcultureについては可溶化物をそのまま ELISAに使用している論文を見つけましたが、後者に関しては 探し出すことが出来ませんでした。 後者の方が価格が圧倒的に安いので、できれば後者を利用したいのですが、 同様の使用方法を試された方がおられましたら、使用感をご教授下さい。 どうぞよろしくお願いいたします。

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