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(無題) 削除/引用 No.8361-4 - 2019/11/02 (土) 12:32:38 - AA universal Forward WT specific Revrese Flox specific Reverse というような組み合わせですと、wild/nullのときにwildバンドしか検出されないので見かけ上wildに見えます トランスジェニックマウスでよくあることで、利用しているプロモーターが生殖細胞系列で発現しないと考えていてもランダムにgermline deletionが起きることがありますので質問者さんのケースも同じ状況だと思います。 (当該プロモーターがgermで真に発現があるのか、非特異的なleakなのかは不明ですが、経験上、転写因子系のCreに多いように思います) なので、null/flox/wildを区別できるPCRを用意しておくことは非常に重要です。 気が付かずにインタークロスを繰り返すとnull/nullが生まれる可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.8361-3 - 2019/11/01 (金) 09:07:01 - GD Mさん、 私の書き方で伝わるか不安でしたが、きちんと伝わったようで安心しました。ありがとうございます。 やはりプライマーを新たに設計した方がいいんですね。了解しました。そのようにしてみます。 見分け方まで指南していただき、感謝しています。 私自身マウスの仕事をやったことがありませんでしたので、ジャームラインディリーションも寝耳に水なことで驚くことばかりです。今回コメントをいただけて、とても心強かったです。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8361-2 - 2019/11/01 (金) 08:33:56 - M いずれにせよ、null (recombined)アレルの検出は必要になる（標的組織での組み換え効率評価目的）と思うので、機能するプライマーをデザインできた方が良いと思います。 wild/nullとwild/wildの鑑別だけなら、そのマウスをflox/floxと掛け合わせて、生まれてきた子マウスのgenotypingで分かると思います。wild/wildなら、子マウスは皆flox/wildになりますし、wild/null ならば半分はflox/null（見かけはflox/flox）になると思います。

特定のCreマウス時のGerm line deletion 削除/引用 No.8361-1 - 2019/11/01 (金) 04:44:26 - GD いつも勉強させてもらっています。 私はこの半年からマウスの実験を行うことになりました。 マウスの交配やgenotyping PCRはテクニシャンが行ってくれています。 オスマウスをflox/flox, Cre+を用い、メスマウスをflox/wild, Cre-を交配に用いています。 tail genomeを用いてgenotyping PCRを行ったところ、予想外なことにまるで野生型のマウス（Cre+でした）が生まれました。このCreはtailでは働かないはずです。 テクニシャン曰く、この野生型と思われるマウスは実は野生型ではなく、おそらくwild/nullではないか、つまり、Germ line deletionだろうと言われました。 つまりそのCreが本来発現するはずのないgerm cellで発現してしまったため、tailのゲノムで組換えが起きたのだろうとのことでした。 そのテクニシャンからwild/nullとwild/wildの遺伝子型を見分けるためにプライマーをデザインしてほしいとお願いされ、floxed exonを跨ぐようにプライマーを2種類合成しました。 ただ、いくつかPCRの条件を振りましたが、うまくPCRがいきませんでした。 そこで皆様に質問させていただきたいのですが、オスマウスをflox/flox, Cre+を用い、メスマウスをflox/wild, Cre-を交配に使う以上、野生型の子供は生まれるはずはないので、genotyping PCRでWTの遺伝子型を持つ子供が生まれたらそれはもうwild/null（つまりGerm line deletion）だろうと結論付けてもいいのでしょうか？それともプライマーを新たに合成すべきでしょうか？ わかりづらい文章になっているかと思いますが、どうかよろしくお願いいたします。

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