BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGEでサンプル・マーカーが流れない]

SDS-PAGEでサンプル・マーカーが流れない

No.8355-TOPIC - 2019/10/28 (月) 03:04:15 - 電気泳動初心者

SDS-PAGEでサンプルを流して、あるタンパク質の発現の様子を見たいと思っています。
非常に小さいタンパク質(8kDa)なので分離ゲルの濃度を20%にしてサンプルを流したのですが、マーカーが分離ゲルに入るところで止まってしまい、サンプルの青色色素はスメアのようになって流れてしまいました。
試しにゲル濃度を12%にしたら問題なく流れたのですが、当然目的タンパク質のバンドは分離出来ませんでした。
電気泳動槽はスラブ式のものを使っています。
原因・改善策を教えていただけましたら幸いです。
　

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No.8355-9 - 2019/10/29 (火) 16:22:29 - 電気泳動初心者

皆様
15%にしたら無事流れました。
確かに20%は濃すぎたかなと思います。

Tris Tricineのことは知らなかったので、今後の参考にさせていただきます。
ありがとうございました。

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No.8355-8 - 2019/10/29 (火) 02:55:07 - おお

20%は流石に濃すぎる、、、どうかな、、、
確かによく見るプロトコールは多くて１８％ぐらい。Gradientだと濃いところで２０％。熱が出るのはAPSの量などで調整可能です。

https://www.abcam.com/protocols/electrophoresis-for-western-blot
こちらでは一番濃いのは２０％ですね。

濃度は質問者が何らかの理由で選んだかもしれないので突っ込まなかったけど。

場合によってはアクリルアミドの濃度よりT/Cを変えたほうがいいかもしれない。

すでに指摘があるようにTris Tricineのシステムも小さいペプチドにはよく使われるので一度ご自身で調べてあなたの実験に使えるか考えてみてもいいでしょう。

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No.8355-7 - 2019/10/28 (月) 23:26:19 - 低分子量泳動乙

PVDFのポアサイズは何ですか？　0.2μmのPVDFを使う必要があると思う。
あと8Kとかのちっちゃいのはアミノ酸組成だのSDSのつき具合だのの影響が大きく現れてくるので、分子量に見合う位置に泳動されないかもしれない。膜への親和性の違いも同様に影響あるかも。10Kより小さくなるとなんか急に変わる。
８Kだとゲル濃度は15%だとギリギリかもしれない。maxで16-17%くらいまでいけると思う。でも20%は流石に濃すぎるし、重合の時に結構熱くもなる。
小さいのは市販の既成のグラジエントゲルも有用。

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No.8355-6 - 2019/10/28 (月) 20:59:15 - おお

ゲルの濃度を２０％にしたから流れないということはないと思うので、ゲルを作るとき何か間違えたか、泳動バッファーなどを作るときに間違えたかだと思う。

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No.8355-5 - 2019/10/28 (月) 18:37:43 - み

15, 16%でも8kDaなら検出できるだろう。
メンブレンへの転写も問題になる可能性がある。
ニトロセルロースとPVDFの両者で試したほうが良い。
Deletion mutant作製したとき、あるサイズより低分子のシリーズがごっそり検出不能になった。
原因はメンブレンの種類で、ニトロでは検出できてPVDFでは全く駄目ということだった。
アルツハイマーのアミロイドベータペプチドなどの検出も同様の工夫が必要とか聞いたことがある。

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No.8355-4 - 2019/10/28 (月) 16:21:39 - あいみょん

よくわかんないからとりあえず、試薬全部作り直して、
低mAで流せば直るんじゃないですかね？

かなり熱をもっていたなら、かなり電流電圧を下げてもらえばいいかと。

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No.8355-3 - 2019/10/28 (月) 03:26:44 - 電気泳動初心者

ちなみに濃縮ゲルは5%です。
電気泳動を止めた時、濃縮ゲルと分離ゲルの境目にかなり熱をもっていました。

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No.8355-2 - 2019/10/28 (月) 03:18:37 - 遠さく推し辞めます。

Tris-Tricine PAGEに変更してみてはどうでしょうか。