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(無題) 削除/引用 No.8332-7 - 2019/10/22 (火) 17:44:59 - asan アガロースで電気泳動して目視でもある程度比較はできるような気はします。目的のようなDNAのクオリティの検証ならそれが一番現実的かつバンドパターンの違いなんかで明らかにおかしければ明確になると思いますが。 human genome DNAの定量ならAluなんかの配列にqPCRをかけてstandard curveを引いてそれとの比較で量を出すことは結構やられてるとは思います。

感謝 削除/引用 No.8332-6 - 2019/10/21 (月) 18:08:08 - しま 初めて書き込みをしましたが、当日にこれだけの意見を頂けるとは思ってもいなかったです。 蛍光のマイクロプレートリーダーはありますので、みなさんの意見を参考に頑張ってみたいと思います。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.8332-5 - 2019/10/21 (月) 17:44:08 - AP プロメガの Quantus, Themo のQubitなどありますが、もし蛍光プレートリーダーがあれば、本体は買わんでも試薬だけ買えばいいです。 それ用の専用機ってのは、それ以外使い道がないわけで、安くても購入は躊躇するよね。汎用のフルオロメーターがどっかにあったら、それ使えばいい。 http://www.tecan.co.jp/img/pdf/technote_inf200_quant_picogreen_j.pdf あと、プロメガは機器のリースをしていてQuantusもラインナップされていたはず。 あおとデモやってもらったこともある。デモ機と試薬数回分。その折は、デモ機は当日引き揚げだったかもしれないが。

(無題) 削除/引用 No.8332-4 - 2019/10/21 (月) 13:28:07 - SYBR master たぶん、ヒトのSTR領域を対象としたqPCRのシステムですが、基本キットなので結構お値段したと思います。ヒトゲノムＤＮＡ定量で探してみてください。 ThermoのAmpFLSTRシリーズが有名ですが、日本で販売していたかどうか知りません。法医学用なので、たぶん結構なお値段です。このタイプ、ＤＮＡ量とDNA分解率の検定を行う物です。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルの定量にも使われています。 また、ヒトゲノム用の定量PCRキットは、培養細胞とかの染色体異常があるもので定量可能かどうかは、キットで定量してからでないと使えなかったと記憶しています。 Qubitって、今30万近いのね。一番最初の簡単なやつ、10万切っていたのに。 マイクロプレートリーダーが対応していれば、フナコシのFitAmp General DNA Quantification Kitがお安いですね。 正確な濃度のDNA(コントロール)さえ用意できれば、EtBrでも定量はできますよ。ただ、キットなどに比べると感度は低いけど。検出限界は覚えていないので、たぶん追加でAPさんが正しい情報くれると思う。DNAコントロールは、キット等に付いてきている、プラスミドとかのコントロールを使えばいいです。

(無題) 削除/引用 No.8332-3 - 2019/10/21 (月) 13:02:18 - ｈ プロメガのFluorometerはQubitよりも安価です

(無題) 削除/引用 No.8332-2 - 2019/10/21 (月) 12:55:29 - おお >nano dropでの測定では、A260/A280が1.8-1.9程度で、数値自体は良好とは思われます。しかし、DNAの分解などの問題でnano dropでは正確に定量できていない可能性があると考えています。 この考察がよく分かりませんが、、、 蛍光が使えるなら、 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.prot4458.citation

nano drop、PicoGreen、Qubit以外でのDNA定量方法 削除/引用 No.8332-1 - 2019/10/21 (月) 12:10:25 - しま いつも参考にさせて頂いています。 DNA global methylationの測定をEpigentek社の「MethylFlash Global DNA Methylation(5-mC) ELISA Easy Kit」を用いて行っていますが、結果に矛盾が生じて困っています。 具体的には ・M.SssIを用いてメチル化させたHeLa DNAに比較して、コントロールHeLa DNAの方がメチル化シトシンの割合が高い。 ・逆に、細胞株にdecitabineを利かせて低メチル化を行ったDNAよりも、同じ細胞株のコントロールDNAの方がメチル化シトシンの割合が低い。 ELISAの検量線はきれいにひけているので、ELISA自体の手技は問題なさそうです（メーカーにもデータを提示し、問題ないだろうと回答いただいています） そのため、現在考えうる問題としては �@DNAの定量が正確でない �AM.SssIを用いたメチル化やdecitabineを用いた低メチル化がうまくできていない。 �Aに関してはバイサルファイトシーケンスで検証中ですが、�@を解決する方法で悩んでいます。 nano dropでの測定では、A260/A280が1.8-1.9程度で、数値自体は良好とは思われます。しかし、DNAの分解などの問題でnano dropでは正確に定量できていない可能性があると考えています。 メーカーの方からは、PicoGreenやQubitを勧められましたが、現在、当研究室に導入しておらず、研究費もあまりないので、できれば安く済ませる方法を探しています。 どなたか、DNA定量の良い代替案はご存じないでしょうか。 research gateではqPCRでできるようなコメントもありましたが、具体的な方法の記載はなく、できればqPCRで定量する方法についても教えて頂けたら幸いです。

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