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(無題) 削除/引用 No.8329-8 - 2019/10/20 (日) 21:24:22 - M P-AKTで、本来見られるべき60kDaではなく、55kDaあたりに弱いバンドを検出した経験があります。ポジコンでは60kDaに出てたので、サイズの差は明らかでした。分解産物の可能性も考えたのですが、pan-AKTでリブロットしても60kDaより小さいバンドが見られず、SDS-PAGEからやり直してAKT1でブロットしても55kDaのバンドは出なかったので、分解産物というよりはP-AKT抗体の非特異バンドと解釈しました。 分解産物の可能性を考えるのであれば、pan-AKTやAKTアイソフォーム抗体で50kDaのバンドが出るか確認して見るのが、てっとり早いように思います。

(無題) 削除/引用 No.8329-7 - 2019/10/20 (日) 14:41:17 - おお ＞このバンドと60kDにも認めましたが、50kDaの方でFBS刺激依存的にバンドの濃さが増加していたので、50kDaのバンドをpAktとして示して差し支えないでしょうか？分解はやむ終えないとして... 都合のいいバンドをピックアップしてそれを示すのはなんというか、昔大騒ぎになったあの、理研の話を思い出してします。あなたが（まあそれ以外の人でもいいけど）同じ実験をして、その時は時間に余裕があって、凍結せずに全部の実験を一日でやり終えたとして、50kDaのバンドがでないなら、そのうえ６０kDaのバンドが血清依存性がないなら再現性がない実験と言わざる負えなでしょう。 まあほんとに分解産物かも実際はわからないわけですし、抗体がExtraなバンドを検出する場合もあって、UnCharacterizedとして解析、解釈するときは無視することもあります。 そういう意味では従来のサイズと思われるバンドで解釈をすることはあると思いますが、あなたの場合のようなときは６０kDaをみるなら、凍結しないでフレッシュで部分的にでも実験を繰り返し（再現性を見るためにも何回かやると思うので）同じ結論が見いだされるか見るべきと思います。 ＞ただこの時にはパイロットなウエスタンをはじめに行い、ローディングコントロールが全て揃っていたことを確認しないと先に進めない実験をしていました。 ちょっとここも改善したほうがいいように思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.8329-6 - 2019/10/20 (日) 10:24:11 - ちき > このバンドと60kDにも認めましたが、50kDの方でFBS刺激依存的にバンドの濃さが増加していたので、50kDのバンドをpAktとして示して差し支えないでしょうか？分解はやむ終えないとして... 自分の次の実験の参考にする、ラボミーティングでみんなに見せて解決方法を募るというならともかく、それ以上公にする(学会発表、論文等)データとしてはまずいのでは。 個人的には、似たような経験があるので、還元し直しに一票ですかね。(新たにやり直すのが大変な場合。)

(無題) 削除/引用 No.8329-5 - 2019/10/20 (日) 04:32:24 - WB ありがとうございます＞＜。 もちろんフェレッシュなサンプルで泳動を始めるのは理想です。 ただこの時にはパイロットなウエスタンをはじめに行い、ローディングコントロールが全て揃っていたことを確認しないと先に進めない実験をしていました。 アクチンが全てのサンプルで均一だとその日確認できたので、翌日同じ量をアプライして泳動したところ、pAkt（T308）が50kDに来ていました。 このバンドと60kDにも認めましたが、50kDの方でFBS刺激依存的にバンドの濃さが増加していたので、50kDのバンドをpAktとして示して差し支えないでしょうか？分解はやむ終えないとして...

(無題) 削除/引用 No.8329-4 - 2019/10/20 (日) 01:13:35 - おお あなたの検出している蛋白で実際に同じ経験をしている人がいるのかもしれませんけど、それが分解によるものと証明した人はほとんどないようにおもいます。 同様に発現という意味でマイナーな蛋白はサンプルバッファーでー８０度で保存してもうまく検出できなくなる事はあることはあるのかなと思います。それが分解かどうかの証明をする事よりも、分解してしまう可能性があるからフレッシュなサンプルを使おうとか、そういう対処方法を考える事のほうが多いのではと思います。ま実際にプロテアーゼイン非ビターを入れたら改善したという人はいるかもしれないのでそういう経験があるかたの話は聞いてみたいと思います。

🥬 削除/引用 No.8329-3 - 2019/10/19 (土) 14:56:35 - 🌶 SDS存在下で加熱してるので、proteinaseなどの酵素反応に起因するものの可能性は低いと思う。（絶対ないとは言わないけど） 思うに多分、還元剤の作用がだんだん低下して、システインのSH基が変な感じで再酸化してきてるんだと思う。final5%くらいになるようにメルカプトエタノール追加で入れて室温で２時間くらい放置してから試してみてください（濃度については当初入れてたbMEは無くなったものとして無視していいです）。 昔、−２０C保存してて、だんだんバンドが不鮮明になったりスメアになったりしてきて、上に書いたみたいににしたら、元のような綺麗なデータに戻ったことあります。凍結融解を繰り返すとこうしたトラブルは起きやすいように思うので、分注して−８０度保存がbetterと思う。 これは個々のタンパク質にもよるので一概に当てはまるわけではないですが、システインの酸化還元状態の違いがSDS-PAGeでの移動度やバンドパタンに影響することは時々あります。

(無題) 削除/引用 No.8329-2 - 2019/10/19 (土) 11:50:13 - AP Aktのことは知らないですが、サンプルバッファー中、ボイル後のサンプルを凍結保存、再融解すると壊れているタンパク質は確かにあります。タンパク質種にもよるんでしょうけれど（市販の分子量マーカーなんて、そんなんで壊れるようじゃ困りますし）。抗体で検出したバンドの様子が変ってこともありますが、なによりCBB染色のパターンが明らかに違っていたりします（バンドパターンの変化、スメア、バンドのボケなど）。

SDS処理したウエスタンサンプルが-20度保存で壊れる？ 削除/引用 No.8329-1 - 2019/10/19 (土) 07:02:17 - WB 質問させていただきます！ 血管内皮細胞を1％トリトンX100を含むCST社のライシスバッファーで壊し、その後、ラエムリサンプルバッファーを加えボイルし、翌日のウエスタンのために-20度保存しました。翌日それが凍ってることは確認しています。 そのサンプルを泳動し、pAkt（T308）抗体でブロットすると、いつもはFBSで30分刺激した時に、ネガコンでは全く出ないものが、60kD付近にバンドがでます。これはデータシート通りです。 ただ、-20度保存したものを泳動した時にそのバンドが50kD付近にもバンドが認められました。このバンドもFBS刺激にのみ出ています。またタイムコースをとっており、FBS刺激したサンプルで60kDと50kDのバンドが出ています。 これらはフレッシュなサンプルを泳動してウエスタンした時にはでませんで、ひょっとしたら-20度保存して翌日までの間、タンパク質(Akt）が分解されてしまっているのではないか？と考えていますが、そのような経験はありますでしょうか？ 他のGAPDHなんかは正常な位置に出ていました。

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