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(無題) 削除/引用 No.8326-7 - 2019/10/19 (土) 04:38:00 - M 薬物処理していないサンプルに限定して、お示しの３つの方法で処理した場合、その膜タンパク質のウエスタンでの検出はどうなりますか？　 加熱還元の条件下では、想定されるサイズのバンドが見られますか？　 加熱非還元の条件下では、そのバンドのサイズが変わりますか？　 変わるのであれば分子間ジスルフィド結合によるホモあるいはヘテロ２量体（あるいは多量体）が形成される可能性を考えますが、そのような事が知られている膜タンパク質ですか？　この場合、タンパク発現量の評価目的であれば、還元条件でウエスタンする方が良いと思いますが、２量体化への影響を見たいのであれば、非還元でのウエスタンが役立つかもしれません。 サイズは変わらないけど、バンドの強さが変わるのであれば、抗体が結合するエピトープが、還元あるいは非還元状態に依存して露出する可能性（例えば、分子内ジスルフィド結合によりエピトープがマスクされる場合は、非還元でバンドが弱くなる）を考えます。この場合は、バンドがより強く出る条件を選択すべきと思います。 もし還元、非還元でサイズやバンドの強さが変わるのであれば、加熱による影響を見るのに「非加熱、還元」の条件も加えたほうが良いかもしれません。無処理のサンプルでウエスタンの条件を設定してから、薬物処理サンプルとの比較を行うと、結果を理解しやすいかもしれません。 私も、７回膜貫通型受容体のウエスタンで泥沼にハマり、最終的にウエスタンを諦めた経験があります。加熱で凝集する場合はウエスタンに固執せず、他の方法も模索した方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8326-6 - 2019/10/18 (金) 09:28:40 - cDNA 私はたまたまボイルすることでアグリゲートするタンパク質を扱っていたので、教科書等にボイルが必須であるような書き方をしないで欲しいと常々思っています。還元・非還元はバンドパターンには大きく影響しますが、結果が逆になるようなケースは少ないと思います。(抗体の結合に影響しない限り） ただ、そのような特に疎水的なタンパク質の場合、セミドライでは転写効率が悪いことがあって、古典的なタンク型でないと検出出来なくなるケースもあります。Western用のタンパク量であればCBBで染めても見えないレベルかもしれませんが、転写後のゲルを染めてみると何か分かるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8326-5 - 2019/10/18 (金) 02:22:55 - おお 加熱した場合一部の蛋白はアグリゲーションにより非常に高い分子量にバンドが現れることもありますが、その可能性を否定できた上で、 非加熱の場合はSDSとサンプルのInteractionなどが不完全である可能性もあると思います。薬物処置で蛋白を取り囲む環境が変わった可能性もあるとしたら面白い結果なのかもしれません。 同じサンプルで加熱したときとしてないときでどちらが従来のサンプルのサイズのバンドのシグナルが強いですか？加熱したほうが弱いなら加熱によるアグリゲーションが起こっている可能性が高そうです。

(無題) 削除/引用 No.8326-4 - 2019/10/18 (金) 00:25:28 - hgf ＞AP様 ＞hjkっっl様 お返事いただきありがとうございます。 アグリゲーションすると違う箇所にバンドがでるだけでなく、そもそも分離ゲルに入らない可能性もあるのですね。 非還元に関しては、以前他の膜タンパク質を検討されていた方の条件をみて行ったのですが、今回はあまり関係なかったのかもしれません･･･ 幸いまだ２サンプルが残っているので、ゲル全体の転写や、穏やかな加熱を行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8326-3 - 2019/10/17 (木) 22:26:33 - hjkっっl このような場合、濃縮ゲルも切り離さずに、転写して、wellの下から分離ゲルの下端まで全体を見てみることは重要と思います。高分子量でwellの真下で止まってたりして分離ゲルに入らないものもあります。いろんな人と話をすると、みなさん非常に限られたところだけ見て仕事を進めてる例はかなり多いと思ってます。あなたのようにいろんな見方をすることで、偉い人たちが見落としていたものを見つけることがあると思います。

(無題) 削除/引用 No.8326-2 - 2019/10/17 (木) 21:27:59 - AP 膜タンパク質のように疎水性ドメインを持つタンパク質は高温で加熱(ボイル)するとアグリゲートすることがあります。そうすると高分子量側に滞って、ボテッとしたスポットになったり、ゲルに入っていかなかったりします。それを非定量的にに免れた標的タンパク質だけを見ている可能性があると思います。 なぜ、還元、穏やかな加熱という実験区を設けなかったか、、、 (非還元は必要ですか？)

SDS サンプルの調製について 削除/引用 No.8326-1 - 2019/10/17 (木) 20:09:40 - hgf Western blotting法にて、薬物処置による膜貫通タンパクの発現変動を確認しようとしています。 サンプルはmembraneではなく、whole lysateを用いて実験しています。 SDSを加えた後のサンプルの処理についての質問です。 最適な処理条件を探すため、�@加熱・還元(メルカプト)、�A加熱・非還元、�B非加熱・非還元の条件で処理を行い、SDS-PAGEで分離し、発現を確認しました。 その結果、�Bの条件で処理したサンプルのみ、薬物処置による発現変動の方向性が真逆となってしまいました。全体的にバンドが見えづらくなったりするのであれば理解できるのですが、方向性が逆になるという点がよく分からず困っております。 用いたサンプルは同じディッシュの細胞から調製したものであるため、処置による影響がそもそも違ったということは考えにくいと思います。 原因について調べてみたのですが、WesternやSDS-PAGEになじみがなく、いまいち分かりませんでした。 何か原因となりうることをご存じの方がいらっしゃいましたら、教えていただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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