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(無題) 削除/引用 No.8323-9 - 2019/10/18 (金) 19:01:52 - qq ねえ、カゼインって糖鎖ついてなかった？ レクチンが何のレクチンなのか分かりませんが、真っ黒なのは、レクチンがカゼインに結合しているのではありませんか？ ブロッキングは、PVP K25の1〜2%溶液が良いような予感です。

(無題) 削除/引用 No.8323-8 - 2019/10/18 (金) 18:32:33 - １q２w３重４r５t６y 予定してる実験に近い実験してる論文を検索していい感じのデータ載せてるラボをいくつかピックアップしてメールで訳を話して実験の詳細聞くのが一番良いと思う（試薬のロットだとかそういうのも重要なので聴く）。いちいち論文に書かないようなところが結構キーポイントだったりすることはよくある。 国内はスルーor担当者卒業してわかりませんみたいな対応されることがあったけど、経験では海外は誠実に対応してくれることがほとんどだった。実験担当した人に転送してくれて、実際の詳しいプロトコルとかも送ってくれる。

(無題) 削除/引用 No.8323-7 - 2019/10/18 (金) 06:15:14 - 風邪気味です... 真っ黒でした... もうレクチンブロットいや...

(無題) 削除/引用 No.8323-6 - 2019/10/18 (金) 03:30:43 - おお >成分不詳、なんかの化学物質のポリマー？ VI. Polyvinylpyrrolidone (PVP) PVP is a protein-free alternative to the traditional blocking buffers. PVP is a water-soluble polymer that readily binds to both nitrocellulose and PVDF membranes. PVP is generally used at concentrations between 0.5-2% and is ideal for eliminating cross-reactivity associated with protein blocking buffers. https://advansta.com/blocking-strategies-westerns/

(無題) 削除/引用 No.8323-5 - 2019/10/18 (金) 00:04:54 - 風邪気味です... みなさん、ありがとうございます... ベクター社って昔からあるABCキットを例にビオチンアビジンに強い会社だと思っていましたが、アビジンビオチン検出系にカゼインでのブロッキングを推奨されていたのですが...どういうことなんでしょうか？ カゼインでのブロックは単にBSAに比べ安価だから、という理由でしょうか？その場合にはビオチンを含まない精製度の高いカゼインを使うことが前提ということも含まれますか？ ならBSAでやっておけばよかった...うわぁぁぁあああああああ。イライラします...

(無題) 削除/引用 No.8323-4 - 2019/10/17 (木) 18:03:24 - 　hjkoiu skim milkの主成分はほぼカゼインです。skim milkはPVDF膜のブロッキングに汎用されているのはご存知のとうりです。ゆえにカゼインはPVDF膜のブロッキングに適さないというのは変ですね。どういう文脈での話かで何か意味があるのかもしれないですが。 一般的にはavidin viotin法ではカゼインは避けることが多い様に思います。リコンビナントとかならいいと思いますが、milk由来だとbiotinが混じっていて反応を妨害するからです。 ならBSAかい、というとこれがまたBSAも純度がかなり高いくないと（あるいはロット差で）、残存する微量の血漿由来の糖タンパク質（血漿タンパク質の中ではアルブミン以外はほとんど棟タンパク質）とレクチンとの反応のせいでback groundが汚くなったりします。なので、レクチンブロットならば、タンパク質を含まない市販の合成blocking剤（成分不詳、なんかの化学物質のポリマー？）が良いと思います。WBでリン酸化タンパク質の検出などでたまに使いますがいい感じです。

(無題) 削除/引用 No.8323-3 - 2019/10/17 (木) 13:42:06 - AP >Note: Casein Blocking Buffer is not suitable for blocking PVDF membranes. Sigmaの独自見解じゃないでしょうか。教科書的にも、他社製品の能書き、実験例から言っても、そんなことはなかろうと思います。 だからまあ、当初の計画通りやったらいいんじゃないですか。 どうせ一発でうまく行かないことのほうが多いんだし、成功するにしても失敗するにしても経験値は上げにはなる。 個人的にはビオチンーアビジン系や抗リン酸化タンパク質抗体を使うときは、カゼイン（ミルクプロテイン）は避けますけど。

(無題) 削除/引用 No.8323-2 - 2019/10/17 (木) 11:46:44 - あ BSAでやってます。 カゼインは精製度にもよりますが、Biotinを含むことが多いため、アビジンとは相性が悪いです。

ストレプトアビジンHRPでのブロット時のブロッキング剤 削除/引用 No.8323-1 - 2019/10/17 (木) 11:16:38 - 風邪気味です... 一次試薬としてビオチン化レクチンを反応後にストレプトアビジンHRPでブロットしたいのですが、この時、ベクター社の試薬で処理をします。 そのために、先ずSDS-PAGE後の膜をシグマ社のブロッキング剤（カゼイン）で前処理後、ベクター社の試薬で処理し、最後にストレプトアビジンHRPでブロットする流れになります。因みに、ストレプトアビジンHRPでブロットする際にはベクター社はカゼインでブロッキングするよう推奨しています。 今、シグマ社のカゼインの添付文書を見たところ、なんと、カゼインでのブロッキングはPVDF膜は適さないと書かれてありました。（Note: Casein Blocking Buffer is not suitable for blocking PVDF membranes.） 私は全てPDVF膜を使っていますので、困惑しています... 今PVDF膜に転写してしまっているのですが、やはり上手くいかないでしょうか？ そもそもなぜにカゼインはPVDF膜と相性が悪いのでしょうか？ ご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけますと幸いです。

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