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(無題) 削除/引用 No.8312-10 - 2019/10/13 (日) 00:15:49 - B2 みなさま ありがとうございました。 結局、最初のプレートから10個拾って2つのインサート持ちを得ることができました。 今週中にシーケンスを読んでみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8312-9 - 2019/10/11 (金) 10:58:42 - ちき 制限酵素によってはたかだか数時間で失活するので、ベクターの切れ残りは基本必ずあるものだと思います。例え泳動で見えなかったとしても。バックグラウンドをすごく気にしていた頃は、ベクターは必ず二回切っていました(一回切って精製してからもう一度切る、あるいは酵素だけ途中で足す)。二回切る効果は絶大で、バックグラウンドは大幅に減ります。少なくとも私の経験では。 あと二種類の制限酵素で切った場合でも(一種類でしか切れていない場合の用心のために)、脱リン酸化していたこともあります。 最近はSLiCEしかしないので、制限酵素サイトでクローニングすること自体がほとんどなくなりましたが。

(無題) 削除/引用 No.8312-8 - 2019/10/11 (金) 10:02:29 - AP >コンピテントセルの形質転換効率は10^7です。 で、50個のコロニーを出したプラスミドの投入量がどれくらいだったのか、というのが知りたかった。 いくつか、助言、確認事項があります。 ・ゲル切り出しのときのUV被爆を無くすか最小限にする対策はしているか。 ・プライマリークローニングのときいきなり発現ベクター（pGEX）をつかうのは賢明でない。pBlueScriptなどクローニングに適したハイコピーのベクターでまずクローニングしてから、発現ベクターにリクローニングするのがいい。クローニングの効率のこともあるし、青白選択で絞れるのがいい。PCRで調製したインサートだからシークエンスの確認は必須だと思うが、pGEXのようなローコピープラスミドよりハイコピーのほうが分析用のプラスミド調製に有利でもある。 ・宿主は？　いきなり発現用の宿主でやろうとしたりしていないか？　発現用は形質転換が起こりにくく（形質転換効率が低かったり、サイズが大きいと入りにくいとか）、組換え欠損体でもないので、やはりプライマリークローニングには向かない。 ・PCRのエラーのことを考えると、たくさんのコロニーをスクリーニングしてなんとか一個か二個取れるというようじゃ不安。たまたま取れたクローンが変異なしのパーフェクトというのはよほどヒキの強い人だ。 ・プライマーに設計した制限酵素サイトは、5'末端に余剰のヌクレオチドを足場としてつけても、切断効率は高くないようだ。切断効率のチェックは、インサートだけでライゲーションしてみて重合が起こるかどうか（末端リン酸化しない限り未消化だとライゲーションしない）を見てみると良い。私のやる限り、かなり入念に消化しても、半分くらいは未重合で残る。うまくいっていないときは重合がほとんど見られないことも。 たぶん、末端がきれいな二重鎖になっていないためで、PCRのサイクル過剰、産物がよく増えすぎて飽和（新規合成より変性した一本鎖どうしが再対合しているような状態？）しているようなときに起きやすいようだ。 ・発現しようとしている遺伝子が大腸菌に対し毒性を持つことがある。発現誘導しなくても、リーキーな発現だけで生えてこなくなることもしばしばある。 そうなるとインサートをもった「当たり」のコロニーに限って生えてこなくなるので、生えてきたのはハズレばかりということになる。 プレートのインキュベート温度を下げる（例えば室温）をにするとそういうのも生えてくることがある。

(無題) 削除/引用 No.8312-7 - 2019/10/11 (金) 06:01:54 - おお >バックが50個出たらプラスミド量を1/5にしてライゲーションするということですよね。 そうです。たいていLigationされていればTransforming activityもされてないものよりは高いですから、ベクターとインサートの組み合わせの相性が悪など何らかの理由でLigation効率などが低くても、ポジのコロニーは生えてくるだろうと思えるからです。５０の中に２つほどポジがある状態では全部調べるかどうかで拾えるかどうか決まるわけで、最悪全部あたってもみんなハズレだったりもします。しかしバックグランドが５個程度なら、全部調べるにしても５個ですから。

(無題) 削除/引用 No.8312-5 - 2019/10/11 (金) 03:38:36 - おお >おおさん >完全に切断されたプラスミドも、大腸菌に取り込まれるとAmp耐性を持たせることができるということですか…？ 大腸菌の中には切れたDNAをつなげたりする酵素がありますよ。 >先ほどライゲーションしていない方が50個ほどと申し上げたのですが、ライゲーションした方も同じく50個ほどでした。 それなら入っている可能性もまあまああるのでコロニーを拾って調べてみるといいでしょう。私は余裕があるときはまずベクターのみをLigationして何個コロニーができるか確認して、バックグランドが１０以下になるような量でInsertをLigationしてTransformationします。

(無題) 削除/引用 No.8312-3 - 2019/10/11 (金) 00:39:39 - AP ベクター量当たりのcfuで言ってくれないと判断つかないですが、50個くらいのバックグラウンドなら十分に低いんじゃないかな。それが原因でクローニングが困難になるというレベルじゃないのでは？完璧に進む化学反応はない。バックグラウンドはある程度出るものです。 どんな手法でも、プラスミドはアルカリ処理を経て精製されるのが普通です。アルカリ処理をすると多かれ少なかれ制限酵素で切れなくなるccc分子が生じます。アルカリ処理により部分変性して正しいレジストリに戻らないプラスミドが生じるためであるということが古くから知られています。ゲル精製でかなり除けますが、これも完璧は難しい。そういう部分変性プラスミドでも形質転換能はインタクトのプラスミドと変わりません。 コンピーテントセルの形質転換効率が10^8 cfu/ug plasmidだとして、50個のコロニーを生じるには、たったpgオーダーかそれ以下の切れ残りが混じっているだけで十分ですよ。

(無題) 削除/引用 No.8312-2 - 2019/10/10 (木) 23:58:58 - おお 切断されたプラスミドにも弱いトランスフォーメーション活性があるという発想はないんでしょうか

ベクターの切れ残り？ 削除/引用 No.8312-1 - 2019/10/10 (木) 23:28:37 - B2 pGEX6p-1を用いてタンパク質を発現しようとしています。 EcoRIとXhoIでベクター、PCR産物を制限酵素消化してライゲーションしようとしています。 ベクター側ですが、電気泳動後に確かに濃い１本のバンドを確認できたのですが、上の方（bpが多い方）にうっすらとバンドがスメアのようにありました。 このバンド（濃い部分のみ）を切り出してライゲーションに用いたのですが、コンピテントセルにベクターonlyのものを加えて蒔いたプレートからも50個ほどのコロニーが生えてしまいました。 空ベクター単体だと無数にコロニーが生えるため、大半は切断できているもののそこそこ切れ残りがあるのだと思います。 原因がわかりません。制限酵素サイトがおかしくなってしまったものもあるということなのでしょうか。 研究室の誰も大腸菌を扱っていないため、誰かに相談しようにもできません。 助けてください…。

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