BioTechnicalフォーラム [CRISPR/Casを用いたゲノム編集の際のドナーDNA]

CRISPR/Casを用いたゲノム編集の際のドナーDNA

No.8296-TOPIC - 2019/10/04 (金) 16:38:14 - ももも

CRISPR/Casを用いたゲノム編集の際のドナーDNAとして一本鎖オリゴヌクレオチドを用いる際は、みなさまどちらで注文されてますでしょうか？

PCRに用いるプライマーと同様、北海道システムサイエンスやインビトロジェンで注文できる合成オリゴでできるのでしょうか。
特別な修飾などは要りませんか？

細胞はマウスES細胞、
Cas9、gRNAなどはpx330プラスミドを用い、
Lipofectamine LTXで導入予定です。
　

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No.8296-6 - 2019/10/07 (月) 15:59:07 - ももも

asan様

ありがとうございます。

> ESの場合はHDR活性は比較的強いので、最近はターゲッティングベクターに耐性マーカーを入れなくてもdonor plasmid のシステムでもクローンは取れるみたいですよ。

donor plasmid のシステムというのは下記URLのようなプラスミドで薬剤耐性か蛍光でセレクションですかね？
https://www.funakoshi.co.jp/contents/7942
https://www.funakoshi.co.jp/contents/63964
僕も通常の遺伝子導入では蛍光でsortして薄く播いてシングルクローンを拾うのが好みなのですが、短いssODNでノックインできるならプラスミドを作る場合と比べてかかる時間が大きく違うので、こちらで何か試してみたいと思います。

> 文献的には長いssDNAを作るplasmidでlong ssDNAを用いた方が効率がいいなどの話もありますが、自分のラボの人がやったが変わらなかったとか言ってました。同様にSCR7などのNHEJ阻害剤も効果は見られませんね。

この辺り貴重な経験談を教えていただきありがとうございます。
ssDNA産生プラスミドやSCR7なども全然知りませんでした。

>
> 後、crispr plasmid vectorをコトラしてやる場合は、これ自体が一定の確率でゲノムにintegrateするので、クローンをとった場合にはそれを確認して置かないといけません。

ありがとうございます。留意しておきます。それから、相同組み換え部位が再度Cas9に切断されてしまうことを防ぐためにドナーDNAにはsynonimous mutationを入れておかないといけませんよね。これをつい忘れてしまいそうですので気をつけます。

(無題)

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No.8296-5 - 2019/10/07 (月) 15:27:04 - asan

ESの場合はHDR活性は比較的強いので、最近はターゲッティングベクターに耐性マーカーを入れなくてもdonor plasmid のシステムでもクローンは取れるみたいですよ。

ホモKnock-in をとるのはちょっと大変ですがやってやれないこともないみたいです。

がん細胞の場合は多くの場合効率が落ちるので現実的には耐性マーカーをfloxかなんかで入れておいてあとで飛ばすみたいな方法を取らないと無理です。

文献的には長いssDNAを作るplasmidでlong ssDNAを用いた方が効率がいいなどの話もありますが、自分のラボの人がやったが変わらなかったとか言ってました。同様にSCR7などのNHEJ阻害剤も効果は見られませんね。

後、crispr plasmid vectorをコトラしてやる場合は、これ自体が一定の確率でゲノムにintegrateするので、クローンをとった場合にはそれを確認して置かないといけません。

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No.8296-4 - 2019/10/07 (月) 13:28:03 - ももも

Promega社のHibitというのを使えば33塩基のタグの挿入でセレクションが可能かもしれませんね。
どの程度発現してくれるかわかりませんが試してみます。

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No.8296-3 - 2019/10/05 (土) 19:00:45 - ももも

asan様

非常に心強いアドバイスを頂きましてありがとうございます。
「普通のカートリッジ精製のprimerで十分」とのことで、小さなゲノム編集も安価にできそうで安心しました。
IDTのUltramerに関しても先日IDTの方から教えて頂きました。こちらはやはり分解を防ぐためにPSボンドという修飾がついているんですね。
asan様は、インサートが入った細胞のセレクションのためにタグ配列(V5辺りですかね)の挿入は試されたことがありますでしょうか？
200bpでしたらtag配列くらいしか使えないかなと思っているのですが、皆様何の方法でセレクションをされているのでしょうか。

(無題)

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No.8296-2 - 2019/10/04 (金) 19:59:26 - asan

普通のカートリッジ精製のprimerで十分ですよ。配列とgRNAの設計の方が影響が大きいです。PAGEまでやってもやらなくてもいいですが、価格に見合った効果はあまりないと思います。

ESならそれで十分です。マウス受精卵ならIDTでUltramerとかを頼めば200塩基まで行けるのでそれがいいかもしれません。

ちなみに一番効率がいいのはcas9タンパク+sgRNAとオリゴを用いてエレポです。リポフェクションでも入るかもしれない。

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No.8296-1 - 2019/10/04 (金) 16:38:14 - ももも

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