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共発現ベクター(pETDuet-1)へのpelBシグナル配列挿入 トピック削除
No.8275-TOPIC - 2019/09/26 (木) 14:30:40 - 植物タンパク質の闇･･･
ある植物由来の膜タンパク質について、大腸菌での異種発現系構築・結晶化を目指しています。

現在、培養条件検討により、目的タンパク質が発現・可溶化できるようになりましたが、活性が確認できません。
そこで、pelBシグナル配列を付加して発現を行いたいと思っているのですが、MCSが二つある共発現用のベクターでpelBシグナル配列を持つものがなく、今使っているコンストラクトを改良しようと思っております。

手元にpET20bはあるのですが、どのようなストラテジーでコンストラクションを行うのが良いでしょうか。

PCRで両端にNco1サイトつけたものを増幅後、ライゲーションしようと思ったのですが、pETDuet-1ではフレームシフトが発生し、そのままNco1サイトを使用することができません。
メチオニンをもう一つつけることも考えたのですが、その場合、

Met-何かｰMet-pelB-目的タンパク質となります。

この場合、正常に発現するのでしょうか？

不勉強で大変恐縮ですが、知恵をお貸しいただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8275-6 - 2019/09/28 (土) 11:49:56 - 植物タンパク質の闇･･･
mon様

ご丁寧にありがとうございました。
PCR後、シームレスクローニングによるコンストラクションをするという方針で行きたいと思います。

今後ともよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.8275-5 - 2019/09/27 (金) 16:39:56 - mon
> この状態は、RBSが近くになく、翻訳がスムーズに進まないということ

最初のRBS-Met(NcoI部位）からのORFのタンパク（目的タンパクとフレームが一致しているなら融合タンパク）が優勢に発現していると思います。
RBSが無くても微量のタンパク翻訳は起こります。T7転写系は強力なので、目的タンパクとフレームが一致していない場合でも大量にあるmRNAから目的タンパクは翻訳されているのでしょう。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用
No.8275-3 - 2019/09/27 (金) 11:26:40 - 植物タンパク質の闇･･･
mon様
お忙しい中、ありがとうございます。

なるほど。最初の開始メチオニンの前にRBSが必要ということですね。勉強になります。

ご回答を拝見して、少し疑問に思ったことをもう一つ伺いたいのですが、お時間許すようでしたらお付き合いください。

端的にいえば、現在のコンストラクションが適当なのか分からなくなってきました。
というのも、現在、pETDuet-1のEcor1サイトにsingle digestionで目的タンパク質の遺伝子を入れております。これには最初にメチオニンがあり、umberコドンもついております。
この状態は、RBSが近くになく、翻訳がスムーズに進まないということになるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.8275-2 - 2019/09/27 (金) 10:09:37 - mon
pET20bやpETDuet-1のクローニング部位周辺配列にも記載がありますが、効率的な翻訳開始には、RBSが必要です（RBSが無くてもごく微量は翻訳されるようですが）。
そのため、RBS-Met-何かｰMet-pelB-目的タンパク質 だとpelB-目的タンパク質の発現は非常に少なくなります。
どうせPCRを行うなら、（T7 promoter-)RBS-pelB-目的タンパク質(-T7 terminator)断片を作製し、そっくり入れればよいと思います。
適当な制限酵素部位が無いなら、InFusionクローニング(LIC)やBsaI(Esp3I)などのTypeIIS制限酵素の使用、Blunt-end ligation等を考えます。

共発現ベクター(pETDuet-1)へのpelBシグナル配列挿入 削除/引用
No.8275-1 - 2019/09/26 (木) 14:30:40 - 植物タンパク質の闇･･･
ある植物由来の膜タンパク質について、大腸菌での異種発現系構築・結晶化を目指しています。

現在、培養条件検討により、目的タンパク質が発現・可溶化できるようになりましたが、活性が確認できません。
そこで、pelBシグナル配列を付加して発現を行いたいと思っているのですが、MCSが二つある共発現用のベクターでpelBシグナル配列を持つものがなく、今使っているコンストラクトを改良しようと思っております。

手元にpET20bはあるのですが、どのようなストラテジーでコンストラクションを行うのが良いでしょうか。

PCRで両端にNco1サイトつけたものを増幅後、ライゲーションしようと思ったのですが、pETDuet-1ではフレームシフトが発生し、そのままNco1サイトを使用することができません。
メチオニンをもう一つつけることも考えたのですが、その場合、

Met-何かｰMet-pelB-目的タンパク質となります。

この場合、正常に発現するのでしょうか？

不勉強で大変恐縮ですが、知恵をお貸しいただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。
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